鵝細小病毒酵母雙雜交的構(gòu)建范文

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《經(jīng)濟動物學報》2014年第二期

1材料與方法

1．1質(zhì)粒、毒株和主要試劑含小鵝瘟病毒SP株VP1基因的pGEX-4T-VP1質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α菌株由吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院預防獸醫(yī)學實驗室保存;質(zhì)粒pGBKT7、酵母菌Y2HGold、YPDA、SD/-Trp、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His等預混營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、AureobasidinA和X-α-Gal均購于ClonTech公司;SfiⅠ、BamHⅠ等限制性內(nèi)切酶、dNTP、ExTaq酶、ExTaqBuffer等均購自TaKaRa公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自O-MEGA公司;DNAGelExtractionKit試劑盒購自AXYGEX公司;酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自TIAN-GEN公司。

1．2引物設計與合成根據(jù)GPVSP株的VP2和VP3基因序列設計引物，序列如下。P1/P5和P3/P5分別擴增帶有SfiⅠ部分酶切位點的VP2和VP3基因;以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，P2/P5和P4/P5分別擴增帶有SfiⅠ完全酶切位點的VP2和VP3基因。引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

1．3VP2和VP3基因擴增以pGEX-4T-VP1質(zhì)粒為模板，擴增VP2和VP3基因。PCR反應體系:pGEX-4T-VP1質(zhì)粒2.0μL、10×ExTaqbuffer5.0μL、dNTP(10mmol/L)4.0μL、P1/P5或P3/P5各1μL(10μmol/L)、ExTaq0.5μL，ddH2O補足50μL。反應條件:95℃10min、95℃35s、62℃45s，72℃90s，共30個循環(huán)，72℃延伸10min。取1μL第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用P2/P5或P4/P5分別擴增含SfiⅠ和BamHⅠ酶切位點的VP2或VP3基因，反應體系和退火溫度同第一輪PCR。

1．4pMD-18T-VP2和pMD-18T-VP3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將上述2種第二輪PCR產(chǎn)物分別經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳，并用AXYGEX的DNA回收試劑盒純化，克隆至pMD-18T載體中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)。挑取陽性菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，參照OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒操作步驟提取質(zhì)粒，再用SfiⅠ和BamHⅠ酶分步酶切鑒定，并送往上海生工公司測序。

1．5誘餌載體pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3的構(gòu)建與鑒定將pMD-18T-VP2和pMD-18T-VP3重組質(zhì)粒分別用SfiⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶分步酶切后克隆至經(jīng)上述2種內(nèi)切酶酶切處理的pGBKT7載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)中。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，雙酶切確認，最后測序驗證。準確無誤的質(zhì)粒可用于轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞。

1．6誘餌載體pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold參照ClonTech公司酵母雙雜交試驗說明書，以PEG/LiAC法制備酵母菌Y2HGold感受態(tài)細胞。分別取pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3誘餌質(zhì)粒5μL和10μL的蛙魚精子DNA(10mg/mL)混勻，同時以pGBKT7質(zhì)粒作對照。加入200μLY2HGold酵母感受態(tài)中混勻;分別加入600μL滅菌的1.1×PEG/LiAC溶液，振蕩混勻，搖床30℃230r/min培養(yǎng)45min;加入80μL的二甲基亞砜后混勻。42℃熱激水浴30min，每隔5min振蕩1次;1.2萬r/min離心5s，棄上清，加入500μL滅菌生理鹽水重懸細胞;取100μL重懸菌液涂布于選擇培養(yǎng)基SD/-Trp，30℃培養(yǎng)3～8d，待長出白色菌落，挑取數(shù)個直徑2mm左右的單菌落液體培養(yǎng)，參照TIANGEN酵母質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，PCR驗證。

1．7誘餌載體pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3對報告基因自激活作用的檢測將轉(zhuǎn)化有pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP3和空質(zhì)粒pGBKT7的酵母菌Y2HGold分別接種于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-Ada/-His、SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA和SD/-Ade/-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal/AbA不同營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)3～6d，觀察菌落生長情況，檢測VP2和VP3基因?qū)蟾婊虻淖约せ钭饔谩?/p>

1．8pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3對酵母菌Y2HGold的毒性作用檢測從SD/-Trp營養(yǎng)缺陷平板上分別挑取轉(zhuǎn)化成功的pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP3和空載體pG-BKT7的酵母菌Y2HGold單菌落(2mm左右)，接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)16～20h，測量OD600，以檢測VP2和VP3蛋白對酵母菌的毒性作用。若試驗組OD600＞0.8，說明誘餌載體無毒性，反之則有毒性。

2結(jié)果

2．1VP2和VP3基因的擴增由圖1可見，以pGEX-4T-VP1質(zhì)粒為模板，擴增VP2和VP3基因，大小分別約1800bp和1600bp。

2．2誘餌載體pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3的構(gòu)建及鑒定pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3質(zhì)粒PCR，擴增出約1800bp(VP2基因)和1600bp(VP3基因)的目的條帶;質(zhì)粒經(jīng)SfiⅠ和BamHⅠ雙酶切，分別得到約7300bp的載體條帶和2條對應的目的條帶(圖2)。測序結(jié)果與pGEX-4T-VP1中的VP2和VP3基因堿基序列一致。

2．3pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3的Y2HGold酵母菌在SD/-Trp培養(yǎng)基上長出白色菌落。分別隨機挑取5個菌落，液體培養(yǎng)，將提取的質(zhì)粒進行PCR驗證，結(jié)果分別在1800bp(VP2基因)和1600bp(VP3基因)附近有目的條帶(圖3)，說明誘餌質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母中。

2．4pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3對報告基因自激活作用檢測pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3轉(zhuǎn)化的Y2HGold酵母菌只在SD/-Trp缺陷固體培養(yǎng)基上生長，在其他缺陷培養(yǎng)基上均未見到菌落生長，也無變藍色現(xiàn)象;其生長特性與空載體pGBKT7轉(zhuǎn)化的酵母菌Y2HGold一致，表明誘餌質(zhì)粒pG-BKT7-VP2和pGBKT7-VP3在酵母細胞中對報告基因沒有自激活作用。

2．5pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3對酵母菌Y2HGold的毒性作用檢測含有pGBKT7-VP2、pGBKT7-VP3和空質(zhì)粒pGBKT7的酵母菌Y2HGold接種至5mL的SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)17h，OD600分別為1.763、2.198和2.035;重復2次，其值均大于0.8。說明這2個誘餌蛋白對宿主酵母菌均無毒性作用。

3討論

病毒感染細胞主要經(jīng)過吸附、穿入與脫殼、生物合成、組裝與釋放等5個步驟，這5個步驟是病毒與細胞蛋白相互作用的結(jié)果，阻斷其中任何一個步驟均可抑制病毒的繁殖。硫酸乙酰肝素是許多細胞的表面成分，也是多種病毒的受體，但其類似物硫酸葡聚糖及其他聚陰離子物質(zhì)在低于細胞毒性濃度下能抑制病毒的感染［9-10］。α-葡萄糖苷酶是乙肝病毒的一種細胞結(jié)合蛋白，參與乙肝病毒衣殼蛋白糖基化過程，與衣殼蛋白的正確折疊組裝有關(guān)，抑制α-葡萄糖苷酶的糖基修飾作用，可以在一定程度上抑制乙肝病毒的復制［11］。所以，病毒的細胞結(jié)合蛋白可以成為藥物靶標，為新型藥物的研發(fā)提供依據(jù)。本試驗成功構(gòu)建了能用于酵母雙雜交系統(tǒng)篩選試驗的VP2和VP3蛋白誘餌載體，為尋找GPV細胞結(jié)合蛋白奠定基礎。

作者：徐浩孟繁興胡桂學董浩張雙齊宇李勇勇單位：吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院