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葛根素（Puerarin）廣泛應用于缺血性心腦血管疾病的治療。隨著臨床的廣泛應用，發(fā)現(xiàn)該藥有溶血反應、過敏反應和肝、腎損害等嚴重不良反應［1～10］。在國家藥品不良反應監(jiān)測中心病例報告數(shù)據(jù)庫中，有關葛根素注射劑的嚴重不良反應報告以急性血管內溶血為主。葛根素注射劑導致急性血管內溶血具有發(fā)病急、進展快、病情危重的特點［11，12］。中國政府藥品主管部門（藥品食品監(jiān)督管理局）已多次發(fā)出加強管理的通告，注意葛根素注射給藥引起溶血的風險評價，并加強臨床監(jiān)控。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，葛根素注射液在高濃度時，24條Beagle犬紅細胞的溶血概率為70％左右。本研究通過體外溶血實驗，探討葛根素注射液對紅細胞膜脆性的影響及葛根素注射液濃度對紅細胞溶血率的關系。現(xiàn)報道如下。
1器材
1.1受試藥物葛根素注射液，購自廣州大日生物科技有限公司，批號01050801，規(guī)格：含50mg/mlPuerarin。
1.2動物白化豚鼠，雌雄各半，體重250～400g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：2003A002。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫25～27℃，相對濕度60%～78%。Beagle犬24只（體重6～8kg，雌雄各半），由廣東省醫(yī)藥工業(yè)研究所Beagle犬養(yǎng)殖場提供，合格證號：醫(yī)動字0014298。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫25～27℃，相對濕度70%～80%。
1.3試劑及儀器氯化鈉注射液（NS），批號：05112102，安徽華源生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；注射用水，批號：200508011，廣州鐵路中心醫(yī)院生產(chǎn)；22XLJ-II型離心沉淀機，上海醫(yī)用儀器廠；SPX－150B生化培養(yǎng)箱，上海康華生化儀器制造廠。
2方法［13］
2.1熱誘導法考察葛根素注射液對紅細胞膜穩(wěn)定性的影響考察葛根素注射液對beagle犬RBC的影響：將6種濃度葛根素注射液（氯化鈉注射液稀釋）分別與0.05ml50%的beagle犬RBC懸液裝于潔凈試管中，混合，搖勻，置50℃生化培養(yǎng)箱保溫30min，同時設陰性(氯化鈉注射液)及陽性(注射用水)對照管。育畢,置冰浴冷卻，2000r/min離心10min，吸取上清液,紫外分光光度計比色，于540nm下測吸光度,計算RBC溶血率。溶血率（%）＝（樣品管的吸光度－陰性對照管的吸光度）/（陽性對照管－陰性對照管的吸光度）×100%。計算平均溶血率，結果見表1及圖1。
2.2葛根素注射液對紅細胞的溶血作用
2.2.1葛根素注射液對Beagle犬紅細胞的溶血作用取狗血10ml，用牙簽不斷挑去纖維蛋白原，成脫纖血，用NS稀釋，搖勻，離心，棄上清液。沉淀的紅細胞再用NS反復洗滌2～3次，至離心后上清液無色。將所得紅細胞按其體積用NS配成2％懸液（當天使用，使用時搖勻）。取試管6支，標號。①～④號管分別加入5％的葛根素注射液0.1，0.2，0.4，0.8ml，加NS稀釋至2.5ml，渦旋15s使其充分溶解。各管葛根素終濃度分別為：1，2，4，8mg/ml。5號加2.5ml的NS（做陰性對照管）；上述5管與2％的紅細胞懸液2.5ml混合，搖勻。6號管加入2％的紅細胞懸液2.5ml，離心，除去NS，加注射用水溶解至5ml，搖勻，作為陽性對照管。將各管置于37℃恒溫箱孵育6h。然后觀察各管的溶血程度及血細胞的凝集；取上清液，離心，用紫外分光光度計于波長540nm下測定吸光度（OD值）。按公式：溶血率（％）＝（樣品管OD值－陰性對照管OD值）/（陽性對照管OD值－陰性對照管OD值）×100%，計算各管的溶血率。此實驗用不同Beagle犬細胞重復4次，求4次結果的平均值。結果見表2及圖2。
2.2.2葛根素對豚鼠紅細胞的溶血作用取健康豚鼠6只，心臟采血3ml，用肝素抗凝。1500r/min離心10min，除去血清，用NS稀釋，搖勻，離心，棄上清液。沉淀的紅細胞再用NS反復洗滌2～3次，至離心后上清液無色。所得紅細胞按其體積用NS配成50％懸液（當天使用，使用時搖勻）。每例動物血樣取試管8支做實驗，標號。1～6號管分別加入5％的葛根素注射液0.025，0.05，0.1，0.15，0.20，0.25ml，加NS稀釋至2.45ml，渦旋15s使其充分溶解。各管葛根素終濃度分別為：0.5，1，2，3，4，5mg/ml。7，8號分別加NS、注射用水2.45ml作陰性及陽性對照管。上述8管均加入豚鼠50%紅細胞懸液0.05ml并混勻，置入37℃恒溫箱孵育6h，然后觀察各管的溶血程度及血細胞的凝集；取上清液，離心，于540nm下測定吸光度（OD值）。按公式：溶血率（％）＝（樣品管OD值－陰性對照管OD值）/（陽性對照管OD值－陰性對照管OD值）×100%，計算豚鼠紅細胞加入不同濃度葛根素試液孵育后的平均溶血率。結果見表3及圖3。
3結果
3.1高溫下葛根素注射液對紅細胞膜穩(wěn)定性的影響結果見表1及圖1。
表1高溫下不同濃度的葛根素注射液對Beagle犬紅細胞的溶血作用（略）
圖1高溫不同濃度葛根素注射液對Beagle犬紅細胞溶血率的影響（略）
結果顯示：熱誘導下，不同濃度的葛根素注射液均能加速紅細胞的破損，隨著濃度的增大紅細胞的溶血率顯著增大，相關系數(shù)r=0.9597。提示高溫條件下葛根素注射液可降低紅細胞膜的穩(wěn)定性，導致溶血率增大。
3.2葛根素注射液對不同動物紅細胞的溶血作用結果見表2～3及圖2～3。
表2不同濃度的葛根素注射液對Beagle犬紅細胞的溶血作用（略）
圖2不同濃度的葛根素注射液對Beagle犬紅細胞的溶血作用（略）
表3不同濃度的葛根素注射液對豚鼠紅細胞的溶血作用（略）
圖3不同濃度的葛根素注射液對豚鼠紅細胞的溶血作用（略）
葛根素注射液均未引起B(yǎng)eagle犬紅細胞和豚鼠紅細胞出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，但一定濃度下可引起明顯溶血。以上結果顯示：葛根素對Beagle犬紅細胞和豚鼠紅細胞的溶血作用結果相同，溶血程度與葛根素濃度呈一定的劑量相關性（相關系數(shù)r分別為0.9614和0.9227）。當體外葛根素濃度>2mg/ml時，豚鼠紅細胞的溶血率>5%，而Beagle犬紅細胞溶血率達到24.5%，這可能與不同種屬動物的紅細胞對葛根素的敏感性不一有關。隨著濃度的增大，Beagle犬、豚鼠紅細胞溶血率均可達到50%以上，高濃度的葛根素試液對紅細胞的溶血作用較為明顯。實驗結果提示，葛根素的溶血作用與藥物的濃度密切相關，高濃度時易引起溶血；臨床用藥應注意葛根素注射液使用劑量及監(jiān)測血藥濃度不宜過高。
4討論
葛根素注射液系按照化學藥物標準生產(chǎn)、管理的中藥注射液，物質基礎明確，可控成分在99%以上，生產(chǎn)工藝成熟，產(chǎn)品質量穩(wěn)定，是中藥西制的成功范例。但近來發(fā)現(xiàn)，葛根素注射液可引起急性血管內溶血，大大限制了它的臨床應用。針對葛根素注射液的不良反應，開展了大量研究工作。文獻報道可能由輔料、免疫或制劑等原因引發(fā)溶血，但未有確切的實驗數(shù)據(jù)和理論能夠闡明不良反應的機理，更談不上行之有效的預防和治療葛根素不良反應的方法。臨床醫(yī)生只好慎用或不應用。因此，闡明葛根素注射液不良反應產(chǎn)生的機理，才有可能解決葛根素注。