葛根素在新生鼠缺氧缺血性腦損傷中神經(jīng)保護(hù)作用范文

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作者：姜泓,王玲,張義和,劉世平,劉廣忠

【摘要】目的:建立新生大鼠缺氧缺血腦損傷(HIBD)模型,觀察新生鼠缺氧缺血后腦組織一氧化氮(NO)和NO合成酶(NOS)及神經(jīng)元凋亡的變化及葛根素對(duì)HIBD的保護(hù)作用及機(jī)制.方法:用7日齡SD大鼠制備HIBD模型，治療組在缺氧缺血（HI）后早期腹腔注射葛根素50mg/kg兩次.在HI后不同時(shí)間測(cè)定腦組織勻漿NO和NOS含量以及神經(jīng)元凋亡數(shù)量.結(jié)果:HIBD組在HI后24h腦組織NO，NOS明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；HI后6h海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞增多，24h達(dá)高峰；葛根素組24h腦組織NO，NOS較HIBD組相比，顯著下降(P<0.05)，同時(shí)海馬CA1區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)在24h較HIBD組明顯減少(P<0.05).結(jié)論:葛根素可通過抑制NOS的表達(dá)，減少NO的過量生成，從而減輕HIBD后的神經(jīng)元凋亡，表明葛根素對(duì)新生大鼠HIBD有保護(hù)作用.

【關(guān)鍵詞】葛根素;一氧化氮;一氧化氮合成酶;神經(jīng)元凋亡;缺氧缺血;新生鼠

0引言

新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）是新生兒期的常見病,是導(dǎo)致死亡和兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因之一，目前尚缺乏特效治療方法.葛根素為豆科葛屬植物野葛干燥根中提取的異黃酮類的主要有效成分之一，在成人的腦血管疾病治療中療效顯著，但在HIE時(shí)的作用鮮見報(bào)道.本研究通過建立新生大鼠缺氧缺血模型，觀察大鼠腦缺氧缺血后腹腔內(nèi)注射葛根素對(duì)腦組織NO和NOS含量及神經(jīng)元凋亡的影響,以探討葛根素在HIE中的作用與機(jī)制.

1材料和方法

1．1材料新生7d齡SD大鼠48只，體質(zhì)量12~16g，二級(jí)動(dòng)物，雌雄不限，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.葛根素注射液購(gòu)自山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，NO及NOS試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（德國(guó)ROCHE公司生產(chǎn)）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，缺氧艙及氧濃度監(jiān)測(cè)儀由第四軍醫(yī)大學(xué)航空醫(yī)學(xué)系提供.

1．2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將48只新生大鼠隨機(jī)分為3組：①葛根素治療組：于缺氧缺血后即刻、4h腹腔注射葛根素50mg/kg.②缺氧缺血性腦損傷組(HIBD)：于缺氧缺血后即刻、4h腹腔注射等量生理鹽水.③假手術(shù)對(duì)照組：僅作頸部切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎，于手術(shù)后即刻、4h腹腔注射等量生理鹽水.

1.2.2新生大鼠HIBD模型的建立以5g/L的氯胺酮麻醉，取仰臥位固定于手術(shù)板上.采取頸正中偏右2~3mm切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，用50絲線結(jié)扎、縫合切口后，恢復(fù)2h置于2000mL常溫常壓缺氧艙，以1.5L/min的速度輸入含80mL/L氧氣和920mL/L氮?dú)獾幕旌蠚怏w，以測(cè)氧儀監(jiān)控氧的濃度為(80±5)mL/L,2h后取出，返回母鼠身邊繼續(xù)哺乳喂養(yǎng).

1.2.3腦組織標(biāo)本的留取于腦缺氧缺血后6h,24h分別麻醉后斷頭取腦并矢狀離斷為左右半球.

1.2.4腦組織勻漿的制備及NO,NOS的檢測(cè)取部分右腦組織漂洗、去除血漬、稱重，按1∶9的比例加入冷生理鹽水，在玻璃勻漿管中充分研碎致勻漿化，取100mL/L腦組織勻漿3500r/min離心10min,取上清液檢測(cè)NO,NOS.具體操作按試劑盒說明.

1.2.4石蠟切片的制備及細(xì)胞凋亡檢測(cè)斷頭后，立即取出部分右腦組織置于中性甲醛（pH7.2~7.4的磷酸緩沖液PBS為溶劑的甲醛）中常溫固定24h，自丘腦中1／3平面行冠狀切片，厚約4mm，依次脫水、浸蠟、包埋，切片厚度約6μm,HE染色，光鏡下觀察確定海馬位置，臨近處的石蠟標(biāo)本連續(xù)切片.切片放入65℃的烤片機(jī)上6h，取出后放入4℃冰箱待用.

原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)：將組織切片依次脫蠟至水后，進(jìn)行TUNEL染色，觀察400倍光鏡5個(gè)視野下平均陽性細(xì)胞數(shù)，具體操作步驟按試劑盒中的說明書進(jìn)行（選用蛋白酶K通透處理）.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用LSDt檢驗(yàn).

2結(jié)果

2.1NO，NOS的變化HIBD在HI后6h腦勻漿NO,NOS水平開始升高，但與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；24h腦勻漿NO，NOS水平明顯增高，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）；而葛根素治療組24h腦勻漿NO，NOS水平顯著低于HIBD，兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05,表1）.

2.2HE染色和TUNEL染色假手術(shù)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織切片無明顯缺氧缺血改變.HIBD組6h缺氧缺血側(cè)海馬組織輕度水腫，可見神經(jīng)元腫脹、變性、空泡形成，核固縮，嗜堿性增強(qiáng)，核仁消失，并可見到凋亡小體；24h細(xì)胞凋亡達(dá)高峰，并見許多壞死細(xì)胞，嗜伊紅深染（圖1）.HIBD組各時(shí)間點(diǎn)其缺氧缺血側(cè)細(xì)胞核內(nèi)均可觀察到凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征為胞體縮小，細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)凝集，密度增高，呈塊狀或顆粒狀，胞核中有棕色顆粒.HIBD后6h其陽性細(xì)胞開始出現(xiàn)，24h最為明顯，呈小片樣分布.凋亡細(xì)胞多位于病變較重的皮質(zhì)的邊緣內(nèi)帶和海馬CA1區(qū)；而假手術(shù)對(duì)照組僅偶見到陽性細(xì)胞；葛根素治療組細(xì)胞凋亡的時(shí)程與HIBD組一致，分布極其相似，但海馬CA1區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)在24h后各時(shí)間點(diǎn)較HIBD組均明顯減少（P<0.05，表2）.表1新生大鼠各組腦勻漿NO,NOS水平表2新生大鼠不同時(shí)間點(diǎn)右側(cè)大腦海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)

3討論

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sp;一氧化氮（NO）和內(nèi)皮素（ET）是一對(duì)由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管舒張和收縮因子，其生物活性相互拮抗［1-2］.NO是一種具有自由基性質(zhì)的氣體生物活性分子,大量研究表明，NO在腦缺氧缺血性損傷中具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性的雙重作用，生理狀態(tài)下，NOS催化LArg和分子氧生成低水平固有型NO，作為內(nèi)皮源性舒張因子具有舒張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、拮抗氧自由基的作用；但HIBD后nNOS及iNOS被激活［3］,NO過度合成則可干擾與生物轉(zhuǎn)化有關(guān)的酶類的活性、破壞DNA結(jié)構(gòu)、抑制線粒體的呼吸功能，具有明顯的神經(jīng)毒性作用［4-5］.

葛根素是從中藥葛根中提取的一種異黃酮單體，其化學(xué)名為4，7二羥基8D葡萄糖基異黃酮.既往研究表明其具有多種藥理作用，包括：改善腦微循環(huán)，提高局部血流量，阻止Na+內(nèi)流，具有Na+通道抑制劑的作用［6］；抑制鉀外流［7］；抗氧化［5］；拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用，減輕谷氨酸鈉、N甲基D天冬氨酸或卡因酸所介導(dǎo)的對(duì)鼠神經(jīng)元的損害［7-8］，葛根素的多種藥理作用與HIBD發(fā)病機(jī)制相關(guān).

本試驗(yàn)通過新生鼠HI后腹腔內(nèi)注射葛根素并測(cè)定腦組織NO和NOS含量及神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化,來探討葛根素在HIBD中神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制.結(jié)果表明HIBD組在HI后24h與對(duì)照組比較腦組織中NO,NOS明顯增高（P<0.05），同時(shí)缺氧缺血后海馬CA1區(qū)和額葉皮質(zhì)可見較多凋亡細(xì)胞DN斷末端標(biāo)記陽性信號(hào)，24h達(dá)高峰，表明腦缺氧缺血后，NOS被大量激活，使NO生成增加，而高水平的NO作為炎性細(xì)胞因子參與神經(jīng)細(xì)胞損傷的過程.本研究表明,外源性給予葛根素可通過抑制NOS的表達(dá)而減少NO過量生成，從而減輕腦組織凋亡，對(duì)HIBD起到神經(jīng)保護(hù)作用.

綜上所述，HI后給予葛根素治療可降低新生大鼠腦組織中的NO含量，對(duì)HIBD有一定的保護(hù)作用，為臨床治療新生兒HIE了理論依據(jù).鑒于該藥在臨床應(yīng)用的安全性,價(jià)格低廉，很有可能成為治療新生兒HIE的有效藥物之一.

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