壓力與溫度在二氧化碳流體提取中的應用范文

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【摘要】在過去的十幾年，超臨界流體萃取技術從天然產物和中草藥中已經成功地萃取和分離了多種活性成分，本文主要針對超臨界流體萃取技術在實際應用方面的幾個問題進行綜述，包括提攜劑的選取、樣品的制備、萃取溫度和壓力的影響、萃取物的采集方法等幾個方面。

【關鍵詞】超臨界流體萃取中草藥天然產物綜述

中草藥及天然產物中有效成分的提取，直接關系到產品有效成分的含量，影響其內在質量、臨床療效、經濟效益及GMP的實施。傳統提取中草藥有效成分的方法有水蒸氣蒸餾法、減壓蒸餾法、溶劑萃取法等，這些方法通常是工藝復雜、耗時、產品純度不高、對環境污染大，而且易殘留有害物質。所以科研工作者們一直在試圖尋找提取效率高、選擇性好、污染小的方法，隨著現代科學技術的不斷發展，涌現出了許多新的分離提取方法，加快了提取過程，提高了提取效率。超臨界流體萃取技術就是其中之一，較傳統提取方法而言，該方法具有簡便、快速、提取率高、無污染等特點。

早在1879年，Hannay等［就發現超臨界乙醇流體對無機鹽固體具有顯著的溶解能力，但超臨界流體萃取(supercriticalgluidextraction，SFE)卻是在近30年來才迅速發展起來的一種新型物質分離、精制技術。所謂超臨界流體（supercriticalfluid，SCF）是指物質處于臨界溫度和臨界壓力時，成為單一相態，即超臨界流體，在超臨界狀態下，流體的性質介于氣體和液體之間，既具有與氣體接近的粘度及高的擴散系數，又具有與液體相近的密度。在超臨界點附近壓力和溫度的微小變化都可以引起流體密度很大的變化，并相應地表現為溶解度的變化，因此可以利用溫度和壓力的變化來實現萃取和分離的過程。超臨界流體萃取技術具有萃取速度快、提取率高、產品純度好、流程簡單、能耗低、過程無有機溶劑殘留等優點［。目前超臨界流體研究范圍涉及食品、香料、醫藥、化工、環保等領域，并取得了一系列的研究進展。本文就超臨界流體萃取技術在中草藥及天然產物中有效成分的分離提取中實際操作方面的幾個問題進行綜述，包括樣品的制備、提攜劑的選擇、萃取溫度和壓力的影響、萃取產物的采集方法等。

1、超臨界流體萃取技術的主要特點

1.1超臨界流體的特點超臨界流體既具有液體對溶質有比較大溶解度的特點，又具有氣體易于擴散和運動的特性，傳質速率大大高于液相過程(超臨界流體的擴散系數為～10-4cm2/s，液體的擴散系數為～10-5cm2/s)。也就是說超臨界流體兼具氣體和液體的性質，即具有較低的粘度和較高的擴散力。所以超臨界流體萃取率高，萃取速度快。

1.2萃取和分離合二為一當飽含溶解物的超臨界流體流經分離器時，由于壓力下降使得流體與萃取物迅速成為兩相（氣液分離）而立即分開，不存在物料的相變過程，無需回收溶劑，操作方便；不僅萃取效率高，而且能耗較少，節約成本。

1.3超臨界流體萃取通常在較低溫度下進行可以有效地防止熱敏性成分的氧化和逸散，特別適合于那些對熱敏感性強、容易氧化分解成分的分離提取。

1.4超臨界二氧化碳流體常態下是氣體，無毒與萃取成分分離后，完全沒有溶劑的殘留，有效地解決了傳統提取方法的溶劑殘留問題。

1.5流體的溶解能力與其密度的大小相關而溫度、壓力的微小變化都會引起流體密度的大幅度變化，并相應地表現為溶解度的變化。因此，可以利用壓力、溫度的變化來實現萃取和分離的過程。

1.6提取速度快、生產周期短超臨界二氧化碳提取（動態）循環一開始，分離便開始進行。一般提取10min便有成分分離析出，2～4h便可完全提取。同時它無需濃縮等步驟，即便加入提攜劑，也可通過分離功能除去。

1.7分離工藝流程簡單超臨界萃取只由萃取器和分離器2部分組成，不需要溶劑回收設備，操作方便，節省勞動力和大量有機溶劑，減小污染。而且操作參數容易控制，因此，有效成分及產品質量穩定可控。

1.8超臨界二氧化碳流體萃取能應用到不同類型的系統中如：分析型設備（萃取釜容積一般在500ml以下），中試設備（1～20L），以及工業化生產裝置（萃取釜容積50L至數立方米）等。

2、超臨界二氧化碳流體萃取流體

雖然超臨界流體的溶劑效應普遍存在，但實際上需要考慮溶解度、選擇性、臨界點數據以及化學反應的可能性等一系列因素，因而文獻上常采用的臨界點流體溶劑并不太多［24］，而以二氧化碳應用最廣泛，因為二氧化碳超臨界密度大，溶解能力強，傳質速率高；臨界壓力（7.39MPa）適中，臨界溫度31.06℃，分離過程可在接近室溫條件下進行；便宜易得，無毒，惰性以及極易從萃取產物中分離出來等一系列優點，當前絕大部分超臨界流體萃取都以二氧化碳為溶劑。由于二氧化碳是一種非極性溶劑，所以二氧化碳流體最適合萃取親脂性的化合物。

對于極性化合物的萃取，通常選用極性較強的流體物質，如：CHClF2(Freon-22)和NO2［25～29］。但是由于NO2流體容易產生爆炸，CHClF2破壞大氣的臭氧層，極大地限制了兩種流體的應用。

水也可作為超臨界流體材料（水的臨界溫度為374.2℃，臨界壓力為22MPa），雖然它對極性化合物有較高的萃取率，但是由于需要較高的溫度，所以不適合萃取那些對熱敏感性強、容易分解的物質，而且在高溫條件下水中的氧有腐蝕性，不僅使有機成分分解，而且可能破壞萃取罐。所以超臨界水流體在實際應用中有很大的局限性。

本文主要討論超臨界二氧化碳流體的應用，其他的超臨界流體在這里不做討論。

3、提攜劑

在超臨界流體萃取過程中，由于二氧化碳是非極性物質，比較適合于脂溶性物質的萃取，但對極性較強的物質來說，其溶解能力明顯不足，此時，為增加二氧化碳流體的溶解性能，通常在其中加入少量極性溶劑，以增加其溶解能力，這種溶劑稱為提攜劑（entrainer），也稱夾帶劑或修飾劑(cosolvent，modifier)。提攜劑通常是有機溶劑，它可以是某一種純物質，也可以是兩種或多種物質的混合物。提攜劑的加入可以大大提高難溶化合物的溶解度，提高萃取效率，降低萃取時間，但是其作用機制至今仍不清楚，可能是由于提攜劑與溶質分子之間的范德華作用力，或與溶質之間形成氫鍵及其他各種化學作用力等影響了溶質在超臨界流體中的溶解度與選擇性；另外，在溶劑的臨界點附近，溶質溶解度對溫度、壓力的變化最為敏感，加入提攜劑后，混合溶劑的臨界點相應改變，如能更接近萃取溫度，則可增加溶解度對溫度、壓力的敏感程度。

Hawthorne等使用超臨界二氧化碳流體萃取薄荷和青蘭中的精油時，在500g的樣品中只加入了0.5ml的CH2Cl2，萃取時間就由90min降低到30min，而萃取率與采用水蒸氣蒸餾法提取4h的結果一致；Lin等萃取黃芩根中極性比較大的黃酮類化合物時，加入濃度為70%的乙醇后，提取率比常規方法提高了12.6%；姜繼祖等采用超臨界二氧化碳流體萃取光菇子中秋水仙堿時，加入濃度為76％的乙醇做提攜劑，結果萃取率提高了1.25倍。

據文獻報道，在天然植物的提取中，至少使用過17種提攜劑，有水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等，其中，乙醇是最常用的一種，雖然乙醇的極性不如甲醇，但是由于乙醇無毒且易與二氧化碳混合，所以在天然植物的超臨界二氧化碳流體萃取中，廣泛采用乙醇做提攜劑］。水也可以做提攜劑，Ling和Saldana等在研究中發現，樣品中含有約10%的濕度時，可以大大提高萃取率；Miyachi等用水做提攜劑，成功地萃取了木酚素和黃酮類化合物。實驗還發現，水和甲醇及水和乙醇的混合溶液做提攜劑時，比單純用甲醇和乙醇的效果好，可能是由于水能增加提攜劑的極性，更有利于極性化合物的提取，Lin等在提取黃芩根中的黃酮時發現，使用70%的甲醇作提攜劑時，其萃取率比純甲醇作提攜劑高1倍；筆者采用超臨界二氧化碳流體萃取朝鮮淫羊藿中的總黃酮時，也發現用70％的乙醇做提攜劑時其萃取效果比用純乙醇高；Anu和Janicot等在超臨界二氧化碳流體萃取的研究中也證實了這一點。

此外，在超臨界流體萃取過程中，還可以根據需要采用不同的提攜劑進行分步萃取，可以得到不同的產物，Palma等用超臨界流體萃取葡萄籽中的酚類化合物時就采取2步萃取，首先采用純二氧化碳作為超臨界流體進行萃取時，主要得到脂肪酸、脂肪族醛類和甾酮類化合物，然后再采用甲醇做提攜劑進行萃取，主要得到表兒茶酸和五倍子酸；Sargenti等用超臨界二氧化碳流體萃取檸檬草時，采用3步萃取，分別加入正己烷、丙酮、甲醇做提攜劑，得到不同的產物。總之，采用何種提攜劑主要取決于樣品及產物的性質，并通過初步試驗確定最佳提攜劑。

雖然加入提攜劑能夠在一定程度上提高萃取率，但是同時也萃取出了更多的雜質，使選擇性降低。此外，如果提攜劑的濃度不合適，反而會降低萃取率，Sanagi等采用超臨界二氧化碳流體萃取可可豆中吡嗪，實驗結果表明，當采用2%甲醇和5%二氯甲烷做提攜劑時，萃取率升高，而采用5%甲醇和2%二氯甲烷做提攜劑時，萃取率反而下降。事實上，并不是所有的超臨界二氧化碳流體萃取過程都需要提攜劑，Ashraf-Khorassani等從醉椒根中萃取了7種內酯，用純二氧化碳流體時萃取率基本上都超過90%，加入乙醇做提攜劑萃取率沒有顯著提高。據報道甚至三萜類化合物在比較溫和的超臨界二氧化碳流體萃取條件下，當無提攜劑存在時，也能獲得比較滿意的萃取率。

提攜劑的加入方式通常有3種：(1)是萃取前將提攜劑直接注入到樣品基質中，這種方法是最簡單、最經濟的方法，但重現性差，是目前最簡單的近似評價不同提攜劑的方法；(2)是將提攜劑與液體二氧化碳在鋼瓶中預混；(3)是用另一泵注入提攜劑，該方法準確度高、重現性好。

4、樣品的制備

樣品顆粒的大小及濕度情況是影響超臨界萃取過程的重要因素。

如果樣品顆粒大，流體滲透速度慢，則萃取時間將延長。Reverchon等在羅勒葉的超臨界二氧化碳流體萃取中發現，研磨成粉的樣品(其粒度在0.17mm左右)，2h就可萃取完全，而樣品顆粒為0.55mm時，萃取5h仍然得不到滿意的萃取率。所以顆粒小的樣品能加快萃取速度，提高萃取率［68］，但如果顆粒過細則影響流體的正常流速，此時，可通過在樣品中填充玻璃珠、沙子等解決這一問題，其作用是這些沙粒可以防止樣品被擠壓成結實的、不能滲透的硬塞，從而保持流體在樣品中的正常滲透］。此外，在超臨界二氧化碳流體萃取槽入口的末端安裝一個金屬過濾器，也有助于保持流體穩定的流速，避免形成流體溝。

在中草藥及天然產物的超臨界萃取過程中，當萃取產物揮發性很強或非常不穩定時，萃取時需要新鮮的樣品，此時，樣品的濕度比較大，在萃取過程中水分容易形成冰堵塞限流器。Lehotay報道，當大約0.3%的水溶解在超臨界二氧化碳流體中，萃取率可明顯提高，而過量的水留在萃取缸中，會使一些易溶于水的物質進入水相，使萃取率降低。除去水的最簡單有效的方法是加入無水Na2SO4，因為無水Na2SO4既能使流體和樣品有效的接觸提高萃取率，又能吸收一定的水分，保留有效的濕度。Polesello和Lang等還發現，在樣品中加入硅膠也可以很好地除去水分。Miller等用硅藻土與含水樣品混合制成顆粒，也能有效的吸收水分。適當加熱限流器，也是有效地解決堵塞的方法。此外，加入提攜劑也是一個簡單而有效地解決堵塞的方法，Weathers等在用超臨界二氧化碳流體萃取濕紅辣椒中的β-胡蘿卜素時，加入的2，2-二甲氧基丙烷，不但是提攜劑，又起到了干燥劑的作用。Heaton等用超臨界二氧化碳流體萃取紫杉中的紫杉烷類成分時，發現當提攜劑甲醇的濃度超過5%時，限流器就不容易被石蠟等物質堵塞。

超臨界二氧化碳流體萃取經常選用干燥的樣品，樣品的干燥過程影響萃取的產率和質量。根據文獻報道，主要有如下幾種干燥方式：冷凍干燥、烘箱干燥、真空旋轉蒸發干燥、自然干燥等。可根據樣品及萃取產物的性質選擇合適的干燥方法。

5、壓力與溫度在超臨界二氧化碳流體萃取中的作用

在超臨界萃取過程中，壓力和溫度是兩個最重要的物理參數，因為流體密度是壓力和溫度的函數，而流體密度決定物質的溶解度，進而影響超臨界二氧化碳流體萃取的萃取率。同時還應該著重指出的是，物質在超臨界流體中的溶解度由兩個因素決定，即物質的揮發性（是溫度的函數）和流體的溶劑化效應（是流體密度的函數）。在超臨界區域，流體密度可以在很寬的范圍內變化，即壓力或溫度的微小變化，均可以大幅度改變流體密度。

溫度一定時，萃取壓力越高，流體的密度越大，對溶質的溶解力越強，但是過高的萃取壓力會受到設備的限制。極性官能團（如羥基官能團）的數量影響溶質的溶解度，需要較高的萃取壓力。Stahl等的實驗結果表明，在壓力低于300bar時，可以選擇性地萃取含有3個羥基的類固醇，但對含有4個羥基的類固醇，或含有3個羥基1個羧基的類固醇及含有1個酚羥基和2個其他羥基的類固醇卻無法萃取出來。Weathers等［在萃取辣椒粉中的β-胡蘿卜素時觀察到，當壓力從338bar降到250bar時，相應的流體密度降低，萃取率急劇下降。采用超臨界萃取五味子中的木酚素時，Choi等發現，如果萃取時間足夠長（30min/100mg樣品），溫度（40～80℃）和壓力(135～340bar)對木酚素的萃取率沒有明顯的影響，但是如果萃取6min，則增大壓力能顯著提高萃取率。

為了在超臨界二氧化碳流體萃取過程中得到較好的選擇性，流體密度是至關重要的參數。Gawdzik等在實驗中發現，在60℃最佳溫度條件下，流體密度控制在0.3g/ml時，萃取物幾乎都是所需要的化合物。萃取揮發性化合物時如果壓力過大，流體密度超過0.80g/ml容易導致甘油三酸酯萃取出來，不但影響萃取物的純度，而且容易造成限流器堵塞。Chouchi等在對橙皮進行超臨界二氧化碳流體萃取時，確定了最佳實驗條件為40℃、77bar（二氧化碳流體密度為0.25g/ml），并且在實驗中發現高流體密度會降低萃取的選擇性。超臨界二氧化碳流體萃取迷迭香、羅勒屬及牛至屬葉中的精油，最佳萃取條件是溫度為40～50℃，壓力為80～100bar［67］。

通過控制壓力，即改變流體密度，可以分餾得到不同的產物。Ibanez等用兩步超臨界二氧化碳流體萃取法，從迷迭香葉中分別得到精油和抗氧化成分，完成第一步的萃取條件是40℃、100bar，第二步萃取是在60℃、400bar的條件下進行的。采用不同流體密度還可以進一步分離萃取物，提高選擇性，Marongiu等用超臨界二氧化碳流體萃取幾種植物葉中的精油，在壓力90bar、溫度-5℃時，首先在第一個分離器沉淀出一些石蠟；然后控制壓力為15～20bar，溫度為15～21℃，在第二分離罐得到揮發油部分。Reverchon等也采用這種方法將萃取物中的石蠟與精油分開。

如果被萃取物不是易揮發性物質，在超臨界二氧化碳流體萃取過程中則需要較高的流體密度。Chun等用超臨界二氧化碳流體萃取紫杉樹針時，在300atm、40℃才能得到需要的產物，而在100atm、40℃，即較低的流體密度條件下，萃取物只有石蠟。用超臨界二氧化碳流體萃取文朵靈生物堿，在最高的流體密度時，得到了最高的提取率。Marleny等用超臨界二氧化碳流體萃取提取二甲麥角新堿時，當溫度保持70℃不變，壓力由100bar增加到400bar時，萃取率提高了85倍，如果在較低的溫度和壓力下，要想得到相同的萃取率，則需要消耗大量的時間和二氧化碳。此外，在進行秋水仙堿等生物堿萃取時，用3%甲醇做提攜劑，當二氧化碳流體密度由0.8g/ml增加到0.9g/ml(247bar)，各種生物堿萃取率增加2～3倍，而壓力不變，溫度由35℃升到40℃，各種生物堿的總提取率變化很小。

溫度對超臨界流體溶解能力的影響比較復雜，壓力一定時，隨著溫度的升高，一方面二氧化碳流體密度降低，導致二氧化碳流體的溶劑化效應下降，使物質在其中的溶解度下降；另一方面物質的蒸氣壓增大，使物質在二氧化碳流體中的溶解度增大。當前者占主導地位時，溶解度呈下降趨勢，后者占主要地位，溶解度呈上升趨勢。Lin等采用超臨界二氧化碳流體萃取黃芩根中的黃酮類化合物，加入70%的甲醇做提攜劑，當壓力恒定時，溫度由40℃升高到50℃，提取率增加10%左右，溫度由50℃繼續升高到60℃，萃取率反而稍微有些下降。Ashraf-Khorassani等和陳鈞等在實驗中也發現了類似的規律。Chiu等萃取銀杏樹中的黃酮類化合物時，發現在一定的壓力下（31.2MPa），隨著溫度的升高，萃取率呈下降趨勢。

總之，隨著壓力的增加二氧化碳流體密度將增大，因而有增加溶解能力的效應，尤其在臨界點附近，壓力對密度的影響特別明顯；與壓力相比，溫度對二氧化碳流體中溶質溶解度的影響要復雜得多。應當指出，影響超臨界二氧化碳流體溶解能力最主要的因素是溶質的性質，這一因素決定該物質能否應用于超臨界流體萃取。

6、萃取物的采集方法

在超臨界流體萃取中，樣品的萃取過程完成后，產物的采集十分重要，如果收集方法不當，會導致被分析物丟失，影響萃取率［89，90］。在天然產物的超臨界萃取過程中，常用的采集方法有：溶劑采集法、固相采集法和在線采集法。

溶劑采集法就是在采集的容器中裝有液體溶劑，在溶劑中收集產物，這是最常用也是最簡便的方法，產物通過限流器出口流入到裝有少量有機溶劑的容器中，常用的有機溶劑有甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷-甲醇、二氯甲烷等等。Sanagi等［64］發現，采集揮發性化合物時，在冷卻條件下，采用不同的有機溶劑，萃取率不同，如-8℃時，用二氯甲烷和丙酮做采集溶劑所得萃取率比甲醇和正己烷高。Smith等［101］認為，用甲醇-冰（-15℃）和丙酮-冰（-60℃）做冷阱采集揮發性化合物均不如液氮（-170℃）效果好。對于非揮發性萃取物的采集，在室溫和低溫條件下，都能得到比較滿意的產率。應該注意的是，有機溶劑的濃度也可能影響采集效果，相同體積的溶劑在相對窄口瓶中比寬口瓶中采集結果更好。

固相采集法就是萃取物采集到填充柱中，填充柱中裝有吸附材料［如：十八烷基硅石（ODS）］或惰性材料(如：不銹鋼珠)，固相采集也是一種比較常用的方法，采集完成后，用適合的溶劑將產物從固相中洗脫下來。在15℃時，用ODS阱采集蛇麻草中的精油和苦味素，用乙腈洗脫保留的化合物。ODS固體阱在低溫也能有效的吸附揮發性物質，通過升溫至45℃用有機溶劑洗脫這些化合物。固相采集可以根據萃取物的性質選擇適合的吸附阱及洗脫劑，并可以進一步提高選擇性。例如：采用硅膠柱收集極性化合物，選用了合適的溶劑洗脫，就能得到滿意的萃取率。但是固相采集法也有它的局限性，如果選擇了不適合的提攜劑，可能導致萃取產物的丟失，因為提攜劑通過吸附阱可能將產物洗掉，這種情況就應該選用溶劑法收集或用空瓶收集。此外，固相采集完成后，洗脫劑的選擇非常重要，不適合的洗脫劑會影響萃取結果。

在線采集法，即采集裝置與其他分析方法的在線聯用。采集裝置與氣相色譜相連，也就是超臨界二氧化碳流體萃取-氣相色譜聯用技術是最成功的一種模式，是分析揮發性化合物的一個有用的方法。Smith等發現，低溫(-10℃)采集對保留揮發性成分是必需的，即在低溫條件下富集揮發性化合物，然后高溫下使其蒸發。

除了超臨界二氧化碳流體萃取—氣相色譜聯用技術外，其他的在線耦合方法也有報道，如：超臨界二氧化碳流體萃取-液相色譜聯用、超臨界二氧化碳流體萃取-紅外聯用、超臨界二氧化碳流體萃取-質譜聯用等。Ramsey等采用超臨界二氧化碳流體萃取-液相色譜-質譜聯用，成功地分析了痕量的成分。和前2種方法相比聯用技術有較高的靈敏度、較小的標準偏差、節省時間，而且對分析揮發性化合物非常有效，但是也存在許多不足之處，如對樣品進樣量的限制，色譜系統易被污染等等。

7、結論

本文從超臨界流體的選擇、提攜劑的選取、樣品的制備、萃取溫度和壓力的影響、萃取物的采集等在超臨界二氧化碳流體萃取實際操作中涉及到的幾個方面進行了綜述。隨著中藥現代化進程的加快，超臨界流體萃取技術以其快速、提取率高、對環境污染小等特點，將在天然植物的提取中得到更加廣泛的應用。