乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型的制備范文

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【摘要】

目的現(xiàn)行方法建立的乳腺癌動(dòng)物模型多用于觀察其生物學(xué)表現(xiàn)，不適于探索新的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移治療方案。本研究通過(guò)改良制作方法建立新型的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，為探索新的治療方法提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。材料與方法采用組織塊包埋法將VX2傳代瘤株種植于30只雌性兔左側(cè)第3只乳頭的乳墊內(nèi)，每周采用觸診法和常規(guī)超聲查看腫瘤及淋巴結(jié)生長(zhǎng)情況。待觸及腫大的淋巴結(jié)后切除乳腺癌組織。第4周隨機(jī)摘取15枚淋巴結(jié)，采用病理學(xué)觀察淋巴結(jié)形態(tài)及組織學(xué)改變。將游標(biāo)卡尺與超聲測(cè)量結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，比較其差異。結(jié)果2周后，26只實(shí)驗(yàn)兔可觸及乳腺內(nèi)質(zhì)韌的類(lèi)圓形結(jié)節(jié)；超聲呈低回聲，邊界欠清，內(nèi)部及周邊血流豐富。約3周后，23只實(shí)驗(yàn)兔的左側(cè)腋窩處可觸及腫大的淋巴結(jié)，病理證實(shí)為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為88.5%，造模成功率為76.7%。超聲與病理兩種方法測(cè)量淋巴結(jié)最大直徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論改良法建立乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型周期短、成功率高、方法簡(jiǎn)單，能夠?yàn)檠芯啃炉煼ㄌ峁﹦?dòng)物模型；常規(guī)超聲能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)狀況，操作方便、快捷。

【關(guān)鍵詞】

乳腺腫瘤；淋巴轉(zhuǎn)移；超聲檢查,乳房；病理學(xué)，外科；疾病模型，動(dòng)物；兔

女性癌癥患者中乳腺癌發(fā)病率最高，30~59歲女性為乳腺癌高發(fā)人群，乳腺癌也是45歲以下女性最常見(jiàn)的癌癥死因[1]，其中腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗造成患者死亡的主要原因。目前針對(duì)術(shù)后淋巴結(jié)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療方法主要有化療、放射治療、永久性粒子植入[2]及實(shí)驗(yàn)階段的淋巴靶向藥物治療[3]，盡管治療方法很多，但乳腺癌病死率依然很高，所以仍需探索新的治療方法、開(kāi)發(fā)新的藥物來(lái)提高乳腺癌患者的生存率和改善預(yù)后。目前建立專(zhuān)門(mén)用于乳腺癌晚期治療研究的大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型報(bào)道較少，VX2組織塊包埋法建立的兔乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型具有成瘤周期短、成功率高等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要探討改良型乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型建立方法的可行性。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

8月齡普通級(jí)雌性新西蘭大白兔30只，體重2.5~3.0kg，購(gòu)自山東省農(nóng)科院（許可證號(hào)SCXK20090013）。西門(mén)子乳腺容積成像系統(tǒng)，型號(hào)ACUSONS2000，探頭為9L4，頻率5~8MHz。

1.2兔VX2細(xì)胞株的制備

8月齡健康雌性經(jīng)產(chǎn)新西蘭大白兔30只，體重2.5~3.0kg；雄性兔1只，體重2.2kg，建荷瘤兔用于取材。用固定器將待接種的新西蘭大白兔固定，鹽酸利多卡因0.5ml以0.1ml/s緩慢局部注射至左下肢內(nèi)側(cè)（已備皮）肌肉豐富區(qū)。用無(wú)菌一次性手術(shù)刀在注射部位切開(kāi)約1.0cm開(kāi)口，鈍性分離皮下筋膜及肌肉，肌肉分離深度約0.5cm。將液氮中凍存的VX2腫瘤組織37℃解凍復(fù)蘇后，裁剪成大小約1.2mm×1.2mm×1.2mm的組織塊接種到切口中[4]，逐層縫合。

1.3乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型的建立

3周后，無(wú)菌條件下將瘤組織取出（直徑約1.5cm），取周邊生長(zhǎng)旺盛的魚(yú)肉樣組織，放入玻璃皿中，內(nèi)盛滴加有慶大霉素的生理鹽水（50ml生理鹽水含慶大霉素2萬(wàn)U），反復(fù)清洗并剔除瘤組織表面的血液和結(jié)締組織。在另一培養(yǎng)皿中用眼科剪將組織塊裁剪成1.0mm3大小的瘤組織塊備用。將實(shí)驗(yàn)兔仰臥位固定于兔臺(tái)上，胸部剃毛，按外科無(wú)菌程序消毒術(shù)區(qū)皮膚，鋪無(wú)菌洞巾。在其左側(cè)胸壁第3乳頭處局部注射利多卡因，輕柔片刻，用手術(shù)刀在距乳頭1cm的外上象限處作弧形切口，長(zhǎng)度約1cm，鈍性分離筋膜暴露乳墊，用眼科鑷子向乳腺實(shí)質(zhì)中央斜插約0.5cm深，并撐開(kāi)少許，做成一直徑約2.0mm的竇道，拔出鑷子壓迫止血，取備用的1塊腫瘤組織植入竇道底部。用直徑約3mm的明膠海綿填塞竇道入口處并輕壓至徹底止血后逐層縫合腹壁。手術(shù)當(dāng)天切口處撒青霉素，術(shù)后3d肌肉注射青霉素20萬(wàn)U/（kg·d）預(yù)防感染。

1.4病理學(xué)檢查

每周采用直接觸診和超聲檢查腫瘤的生長(zhǎng)情況，并記錄腫瘤最大直徑，用超聲觀察腫瘤內(nèi)部血流特點(diǎn)。待直接觸診能觸及質(zhì)硬的淋巴結(jié)后行外科切除種植的乳腺癌組織，保留乳頭。第4周超聲檢查完畢后隨機(jī)取出15枚淋巴結(jié)做常規(guī)病理，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、包埋和HE染色。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0軟件，淋巴結(jié)最大直徑比較采用配對(duì)資料t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1模型成功率

30只兔造模，2周后26只成功長(zhǎng)出乳腺移植瘤，造模成功率為86.7%；3周后23只發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為88.5%（23/26），造模成功率為76.7%（23/30）。種植于乳腺的瘤組織1周即可用觸診法觸及，質(zhì)韌，活動(dòng)度差，呈類(lèi)圓形。3、4周即可觸及質(zhì)地較硬的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。

2.2常規(guī)超聲

3周后超聲可見(jiàn)乳頭下類(lèi)圓形的低回聲實(shí)性暗區(qū)，邊界尚清（圖1A），大小見(jiàn)表1；彩色多普勒血流顯像（CDFI）示腫瘤周邊和內(nèi)部可見(jiàn)豐富的血流（圖1B），血流速度較低。4周后可見(jiàn)腫大的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)內(nèi)明顯的低回聲暗區(qū)，邊界清楚（圖1C），大小見(jiàn)表1；CDFI示淋巴結(jié)周邊和（或）內(nèi)部血流信號(hào)豐富（圖1D）。阻力指數(shù)為0.35±0.05。

2.3病理學(xué)檢查結(jié)果

轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)肉眼可見(jiàn)表面凸凹不平，表面大量的微血管生成（圖2A），形態(tài)不規(guī)則，淋巴結(jié)門(mén)消失，大小（8.1±1.1）mm；縱行切開(kāi)其內(nèi)可見(jiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，呈魚(yú)肉樣，邊界不清；高倍鏡下可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞體積大，核異型性明顯，呈多核，核漿比明顯增大（圖2B）。采用超聲與病理兩種方法測(cè)量的淋巴結(jié)最大直徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.617，P>0.05）。

3討論

乳腺癌模型的建立方法有自發(fā)性乳腺癌動(dòng)物模型、誘發(fā)性乳腺癌動(dòng)物模型和移植性動(dòng)物模型。隨著科技的進(jìn)步，基因敲除、基因打靶等技術(shù)為基因工程型[5]乳腺癌動(dòng)物模型提供了技術(shù)保障，腫瘤基因模型也應(yīng)運(yùn)而生。盡管這些方法建立的動(dòng)物模型均能引起淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但是自發(fā)性乳腺癌動(dòng)物模型建立周期長(zhǎng)，且腫瘤發(fā)生步調(diào)不一致；誘導(dǎo)性動(dòng)物模型腫瘤形態(tài)各異，差異較大，惡性程度低，因此這兩種方法在治療方法和抗腫瘤藥物的實(shí)驗(yàn)研究方面應(yīng)用尚不廣泛。盡管轉(zhuǎn)基因法成功地建立了MMVT-Wnt-1轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌動(dòng)物模型，但其體積小，對(duì)于創(chuàng)傷性大的外科手術(shù)耐受性差、條件要求高，帶瘤生長(zhǎng)周期短，不適合用于治療方法的探索。移植性乳腺癌動(dòng)物模型是用乳腺癌組織或細(xì)胞以至于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培養(yǎng)出來(lái)的模型[6]，移植方法包括腫瘤組織接種、組織塊懸液接種、細(xì)胞懸液注射等[7]。細(xì)胞懸液注射法過(guò)程復(fù)雜，影響實(shí)驗(yàn)因素多，且轉(zhuǎn)移率不高，高薇[8]將細(xì)胞懸液注射到裸鼠皮下，乳腺癌建模成功率為100%，但是無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。凌瑞等[9]應(yīng)用新西蘭大白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立乳腺癌模型，具有較高的轉(zhuǎn)移率（91.3%）。本實(shí)驗(yàn)研究以上述學(xué)者的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)并進(jìn)一步改良，使之成為適合實(shí)驗(yàn)研究的乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型制作方法。傳統(tǒng)的組織塊接種法是將瘤組織種植于乳墊內(nèi)，后續(xù)對(duì)原位移植瘤未進(jìn)行處理，此法建立的乳腺癌模型不適用于復(fù)發(fā)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移治療方法的研究。改良法建立兔乳腺癌淋巴結(jié)模型是先將VX2組織塊接種于左側(cè)第3乳墊內(nèi)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以后再將原位種植的VX2移植瘤進(jìn)行外科切除，此法的優(yōu)勢(shì)為：①種植成活率高，生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，生長(zhǎng)迅速。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量研究將VX2瘤株種植于肝、腎、肌肉、骨、膀胱、子宮、肺等部位，建立相應(yīng)的原位腫瘤動(dòng)物模型[10-11]。②瘤塊包埋法建模簡(jiǎn)便易行、創(chuàng)傷小，原位成瘤率高，異位接種少。③建立方法改良后更接近于人類(lèi)乳腺癌術(shù)后的情況。④排除了實(shí)驗(yàn)中非實(shí)驗(yàn)因素的影響。如果不切除原位腫瘤而在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生了其他區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則不能判斷在治療淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面是否為失敗；凌瑞等[9]研究兔VX2乳腺癌模型4周后出現(xiàn)液化壞死，如果伴發(fā)感染后動(dòng)物死亡則不易確定死亡原因。⑤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高[10,12]，本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)兔均發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與徐磊[13]的研究結(jié)果相似，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高。采用超聲檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，只需簡(jiǎn)單掌握超聲操作方法即可。本實(shí)驗(yàn)采用VX2腫瘤組織塊包埋法建立兔乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，符合理想動(dòng)物腫瘤轉(zhuǎn)移模型應(yīng)具備的特點(diǎn)：①模擬了人類(lèi)腫瘤轉(zhuǎn)移途徑，即有原發(fā)灶的逃逸過(guò)程。人類(lèi)乳腺癌最主要的轉(zhuǎn)移途徑為淋巴道轉(zhuǎn)移，該實(shí)驗(yàn)的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為88.5%，低于凌瑞等[9]報(bào)道的91.3%，其可能原因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件、瘤組織活性及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身的差異所致。②造模方法簡(jiǎn)單、易于接受，而且腫瘤生長(zhǎng)應(yīng)一致，可重復(fù)性建模，成瘤周期短，原位腫瘤成瘤期為2周，淋巴轉(zhuǎn)移發(fā)生在3~4周。③腫瘤的病理生理特點(diǎn)與人類(lèi)的腫瘤一致。④建模過(guò)程中動(dòng)物死亡率低、損傷小，本實(shí)驗(yàn)無(wú)動(dòng)物意外死亡。⑤實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)環(huán)境污染及人體危害小。

4結(jié)語(yǔ)

總之，改良法建立動(dòng)物模型成瘤周期短、方法簡(jiǎn)單易操作、轉(zhuǎn)移率高，能夠用于人類(lèi)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移治療方面的實(shí)驗(yàn)研究。超聲法探查和檢測(cè)移植瘤的生長(zhǎng)及特點(diǎn)操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快捷。

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作者：劉峰 單位：濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)系濰坊醫(yī)學(xué)院心理學(xué)系