電針老鼠耳穴升壓神經活動的影響范文

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本文作者：劉坤李亮賁卉趙玉雪榮培晶高昕妍朱兵單位：中國中醫科學院針灸研究所

臨床觀察顯示針刺對原發性高血壓患者有良好的治療效果［1］。臨床及實驗研究結果表明，針刺降壓有一定的穴位特異性，其中針刺“耳甲”“足三里”“曲池”“豐隆”等穴有較好的降壓作用［2－4］，而“內關”“公孫”“百會”等穴有一定的升壓作用［5－7］。針刺對血壓的調節，是由脊髓及脊髓上中樞協同完成的。針刺引起的體表－內臟反射有脊髓固有反射及脊髓上反射兩種形式，也是針刺調節心血管功能的重要神經反射形式［8］。其中對脊髓節段性反射的研究較多，得出了公認的結論［9］。孤束核（nucleusofthesolitarytract，NTS）位于延髓背側，參與心血管、呼吸、胃腸等多種內臟功能的調控，也是心血管壓力感受性反射的第一級感覺中繼站［10－12］。在血壓的調節過程中，NTS與迷走神經背核、延髓頭端腹外側核（rostralventrolateralmedulla，rVLM）、延髓尾端腹外側核（caudalventrolateralmedulla，cVLM）、疑核等中樞核團有纖維聯系，通過交感和副交感神經傳出通路完成對血壓的調節［13］。還有研究表明，不同軀體部位及耳針刺激信息的傳入，通過間接和直接的途徑到達NTS進行匯聚［14－16］。我們認為針刺信號可以通過影響NTS中特定的與血壓調節有關的神經元，以體表－心血管反射的形式完成對血壓的調控。但對于NTS中與血壓調節有關神經元的鑒別及機體不同血壓狀態下針刺效應的同步研究，目前尚不多見。本實驗擬觀察不同穴位電針對麻醉大鼠血壓的影響，同步記錄NTS細胞外電活動，探討針刺在不同血壓狀態下的降壓作用，闡明NTS升壓反射相關神經元在針刺降壓過程中的變化特點，以深入探討針刺降壓的中樞機制。

1材料與方法

1．1動物健康成年Sprague－Dawley雄性大鼠（250～350g）47只，中國醫學科學院實驗動物中心提供，清潔級，實驗動物許可證號：SCXK（京）2009－0017，飼養于12h光照／12h黑暗的環境中，自由飲水和攝食。實驗過程中對動物的處置遵照科技部的《關于善待實驗動物的指導性意見》規定。

1．2主要試劑與儀器脫羥腎上腺素（Phenylephrine，PE，Sigma）；立體定位儀（SR－6R，日本光電），推進器（DMA－1510，美國），微電極放大器（Model1800，美國），Micro1401mR生理信號采集分析系統（CED，英國），BIOPAC（MP150多道生物信號采集分析系統，美國），微量注射泵（ALC－IP800，上海奧爾科特生物科技有限公司），刺激器（SEN－7203，日本光電），隔離器（SS102J，日本光電），動物恒溫系統（ALC－HIP，上海奧爾科特生物科技有限公司），玻璃微電極拉制儀（ModelP－97，美國），針灸針（0．25mm×30mm，蘇州醫療用品廠），冰凍切片機（Thermo，MicromInternationalGmbH，德國）。

1．3實驗動物制備大鼠用10％烏拉坦（1．0～1．2g／kg）腹腔注射麻醉。手術及實驗過程中動物體溫用恒溫儀維持在37℃左右。動物行頸靜脈、頸動脈、氣管插管術后，動脈插管通過三通與注射器和壓力傳感器相連，實時記錄及監測平均動脈壓（meanarterialpressure，MAP）的變化，注射器內留置2mL200U／mL的肝素，以防血管堵塞。靜脈插管直接與注射器相連，以備靜脈用藥。動物俯臥，將大鼠頭部用耳棒固定于立體定位儀上，暴露小腦后端及延髓。在顯微鏡下剝離軟腦膜，暴露的腦組織用溫的石蠟油覆蓋。以立體定位儀確定NTS坐標位置：閂部上下1．0mm，中線旁開0～1．0mm，深度0．3～0．8mm。在手術顯微鏡下插入玻璃微電極至延髓表面，隨即以石蠟油覆蓋以防止干燥及減少延髓波動對微電極位置的影響。玻璃微電極在P－97微電極拉制儀上拉制，尖端直徑1μm左右，測定微電極直流電阻應為10～15MΩ，記錄前灌沖2．0％醋酸滂胺天藍電極液。

1．4實驗記錄同步記錄NTS神經元放電及MAP，在微電極推進器下，以2μm／s的速度推進玻璃微電極，在0．3～0．8mm深度之間尋找放電穩定的神經元；在此基礎上經靜脈注入PE（4μg／kg），以鑒定該神經元對MAP上升的反應。MAP升高超過10mmHg（1mmHg≈0．133kPa）、NTS神經元放電頻率增加或減少15％即界定為血壓相關神經元。待NTS神經元自發放電穩定、MAP恢復至正常后，記錄30s放電脈沖數作為對照值，然后電針耳穴“心”及體穴“內關”“足三里”各30s，各穴電針時間間隔至少在5min以上。為排除針刺穴位順序對神經元放電結果的影響，穴位隨機排序，觀察電針對MAP及NTS神經元放電的影響。以0．2mL／min（2μg／mL）的速度在大鼠頸靜脈微量注射PE（6～12μg／kg，維持15～30min）造成藥物性血壓升高超過15mmHg及以上。在升壓平臺期再分別電針上述穴位，并觀察其對MAP和NTS神經元放電的影響。神經元放電的信號經微電極放大器放大，MAP信號經BIOPAC轉化為電信號后輸入Micro1401mR生理信號采集分析系統，SPIKE2軟件進行數據處理。神經元放電記錄結束后，用刺激器通過隔離器經微電極放大器向玻璃微電極通以20μA的陰極直流電20min，將玻璃微電極內2％的醋酸滂胺天藍電極液導入腦組織以標記記錄位置。灌流切片后確認正確的記錄位點，位置不符合者數據不納入統計。

1．5穴位定位及電針刺激按照《實驗針灸學》［17］選穴。左“足三里”穴在左腓骨小頭下約5mm處；左“內關”穴在左前肢1／6折點處外側，橈、尺骨縫中；左耳穴“心”在耳甲腔中央。電針強度2mA，頻率10Hz，波寬500ms，參考電極放在穴位旁開0．5mm處。

1．6統計學處理血壓數據用均值±標準誤（x珚±sx珔）表示，針刺前后比較用配對t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間進一步的兩兩比較采用LSD檢驗，均以P＜0．05作為差異有統計學意義的標準。據本研究組以往對NTS神經元自發放電的研究，以刺激前后放電頻率超過15％作為標準，神經元對針刺的反應分為興奮、抑制和無反應，刺激后頻率變化增加15％判斷為升壓反射相關神經元。神經元對刺激反應的分類個數屬計數資料，神經元放電變化表示為增加百分比，組間變化率的比較采用LSD分析。以上數據輸入SPSS13．0統計軟件進行統計分析。

2結果

2．1NTS與升壓反射有關的神經元的鑒別麻醉大鼠頸靜脈注射PE后，在記錄動脈血壓升壓反射的同時，分辨并完整地記錄到67個NTS神經元細胞外放電，其中15個細胞（22．39％）放電頻率增加，呈興奮反應，放電頻率的凈增加率為（63．59±13．21）％；36個神經元（53．73％）放電頻率無變化；16個神經元（23．88％）放電頻率減少，呈抑制反應，放電頻率的凈降低率為（49．28±11．50）％。

2．2電針作用于耳穴“心”及體穴“內關”“足三里”對大鼠生理狀態下MAP及NTS神經元放電的影響如圖1所顯示的單個例子，電針耳穴“心”和體穴“足三里”能夠明顯降低實驗動物的MAP，與此同時，NTS與升壓反射相關神經元的放電明顯增加；電針“內關”雖然也能輕度激活NTS神經元放電，但對MAP沒有明顯影響。正常大鼠的MAP范圍為82～120mmHg。統計結果表明（圖2），生理血壓狀態下，電針耳穴“心”使動物的MAP由原來的（100．11±3．30）mmHg下降為（88．47±3．75）mmHg，下降了（11．64±0．45）mmHg（P＜0．001）；電針“足三里”使MAP下降了（5．74±0．64）mmHg（P＜0．001）；電針“內關”對MAP無顯著影響（P＞0．05）。不同穴位組間降壓效應比較顯示，電針耳穴“心”和體穴“足三里”對MAP的影響大于“內關”（P＜0．05）。針刺不同穴位引起MAP變化的同時，對生理MAP狀態下NTS與升壓反射相關神經元的放電頻率的影響以興奮性為主。對升壓反射有興奮性反應的15個神經元待MAP恢復至生理狀態時，電針大鼠耳穴“心”，8個放電頻率增加［凈增加率為（115．20±15．25）％］，7個放電頻率無變化或減少；電針“內關”穴，7個神經元放電頻率增加［凈增加率為（54．24±6．89）％］，8個放電頻率無變化或減少；電針“足三里”穴，7個神經元放電頻率增加［凈增加率為（103．35±14．78）％］，8個放電頻率無變化或減少。組間比較結果顯示，電針耳穴“心”和“足三里”兩個穴位對神經元激活增加的百分比較“內關”穴顯著增高（P＜0．05）。見圖3。

2．3電針作用于耳穴“心”及體穴“內關”“足三里”對PE引起MAP升高狀態大鼠MAP和NTS神經元放電的影響在大鼠頸靜脈注射PE造成藥物性升壓模型，MAP由生理的（99．28±3．82）mmHg，上升并維持在（121．66±2．91）mmHg。如圖4所顯示的單個例子，電針耳穴“心”和體穴“足三里”能夠明顯降低實驗動物升壓平臺期的MAP，與此同時，NTS與升壓反射相關神經元的放電明顯增加；電針“內關”雖然也能輕度激活NTS神經元放電，但對MAP沒有明顯影響。統計結果表明（圖5），在PE引起的升壓平臺期，電針耳穴“心”使動物的MAP由原來的（124．17±4．43）mmHg下降到（118．70±3．64）mmHg，下降了（8．30±0．79）mmHg（P＜0．001）；電針“足三里”使MAP下降了（6．07±0．79）mmHg（P＜0．05）；電針“內關”對MAP無明顯影響（P＞0．05）。組間比較顯示，電針耳穴“心”和體穴“足三里”的降壓效應好于“內關”（P＜0．05）。比較同一穴位電針對麻醉大鼠生理狀態和PE引起血壓升高狀態下MAP的影響，結果表明兩種狀態下MAP的差異無統計學意義（P＞0．05）。電針不同穴位引起升壓平臺期MAP變化的同時，對NTS與升壓反射相關神經元的放電頻率的影響以興奮性為主。對升壓反射有興奮性反應的15個神經元中，電針耳穴“心”，9個放電頻率增加［凈增加率為（92．94±10．42）％］，6個放電頻率無變化或減少；電針“內關”穴，9個神經元放電頻率增加［凈增加率為（44．66±6．27）％］，6個放電頻率無變化或減少；電針“足三里”穴，8個神經元放電頻率增加［凈增加率為（86．73±5．57）％］，7個放電頻率無變化或減少。組間比較結果顯示，電針耳穴“心”和“足三里”兩個穴位對神經元激活增加的百分比較“內關”穴顯著增高（P＜0．05）。見圖6。

3討論

頸動脈竇和主動脈弓壓力感受器反射是交感神經和副交感神經通過上位中樞調節MAP的重要途徑［18］。這種負反饋調節形式在一定血壓范圍內比較敏感（100mmHg左右），且調定點隨動脈血壓狀態可以重新調定。如高血壓時調定點上移，壓力反射調節可以在血壓較高水平上工作［19］。交感神經活動過度興奮和動脈血壓調定點上移是高血壓病的主要病理機制［20］。與血壓調節有關的中樞主要包括下丘腦弓狀核、rVLM、cVLM、中腦導水管周圍灰質腹外側區、蒼白球、脊髓背角和中間外側部［21］。NTS是內臟感覺傳入到上位中樞的第一級中繼站，和rVLM之間有著雙向的纖維投射［22］，電生理學實驗也證明NTS存在對血壓反射敏感的神經元［23］。壓力感受器傳入首先投射到NTS神經元，由此直接或間接與血壓感受反射的迷走傳出（疑核）和交感傳出（通過rVLM和cVLM的神經元）中樞聯系，調節心血管功能狀態，從而調節血壓［24］。Zhang等［25］對麻醉大鼠的研究表明，NTS內存在對升壓反射敏感的神經元，但不對血壓的絕對升高有持續反應，動脈血壓高水平范圍內的自穩調節是多種傳入編碼的結果，而不是由單個神經元階梯狀放電的變化介導的。NTS接受主動脈減壓神經（ADN）傳入的神經元大多數對血壓的增加產生興奮性的反應，我們的研究可能既包含了ADN傳入的NTS神經元，也包含了有自發放電但與ADN激活無關的NTS神經元，NTS神經元對PE引起的升壓反射既有興奮性反應也有抑制性反應，但以興奮性反應為主。本研究組及其他研究組前期工作表明，麻醉大鼠在生理血壓狀態下，刺激與心交感神經支配同節段的“內關”穴，主要引起交感神經興奮效應，通常不產生降壓作用，而刺激與心異神經節段的“足三里”穴能抑制交感神經功能引起降壓效應［26］。也有人認為，電針“足三里”能抑制NTS內側亞核P物質的釋放并且能夠激活c－fos基因在中樞延髓和背核中的表達，即電針“足三里”穴可以增強迷走中樞的興奮性［27］。耳穴由于有迷走神經耳支的支配，也引起穩定的降壓效應。如高昕妍等［2，28］的研究表明，針刺“耳甲”激活副交感神經電活動能降低大鼠血壓，此降壓效應與迷走神經中樞功能與結構的完整密切相關，特別是與NTS中心功能相關神經元的激活有關。自發性高血壓大鼠的實驗研究表明，針刺耳穴“心”能引起比正常大鼠更顯著的降壓作用［2］。而本研究藥物引起的血壓升高平臺期（平均120mmHg）與自發性高血壓大鼠的基礎平均血壓（180mmHg）有明顯不同。另外，PE作為腎上腺素能α受體激動劑，使周圍與交感神經α受體有關的功能均上調，如：使除冠狀動脈以外的小動脈強烈收縮，引起外周阻力明顯增大而引起血壓升高等［29］。因而本實驗中針刺對血壓升高大鼠的降壓幅度與正常大鼠差異不明顯。根據本實驗結果，結合以往研究，我們認為針刺耳穴“心”和體穴“足三里”在生理狀態和藥物引起血壓升高狀態下都有一定降壓作用，這種降壓效果與NTS中升壓反射敏感神經元的同步放電有關，這些升壓反射相關神經元對針刺的反應以激活為主，并且存在一定的穴位特異性。