電針老鼠耳穴升壓神經(jīng)活動(dòng)的影響范文

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本文作者：劉坤李亮賁卉趙玉雪榮培晶高昕妍朱兵單位：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所

臨床觀察顯示針刺對(duì)原發(fā)性高血壓患者有良好的治療效果［1］。臨床及實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，針刺降壓有一定的穴位特異性，其中針刺“耳甲”“足三里”“曲池”“豐隆”等穴有較好的降壓作用［2－4］，而“內(nèi)關(guān)”“公孫”“百會(huì)”等穴有一定的升壓作用［5－7］。針刺對(duì)血壓的調(diào)節(jié)，是由脊髓及脊髓上中樞協(xié)同完成的。針刺引起的體表－內(nèi)臟反射有脊髓固有反射及脊髓上反射兩種形式，也是針刺調(diào)節(jié)心血管功能的重要神經(jīng)反射形式［8］。其中對(duì)脊髓節(jié)段性反射的研究較多，得出了公認(rèn)的結(jié)論［9］。孤束核（nucleusofthesolitarytract，NTS）位于延髓背側(cè)，參與心血管、呼吸、胃腸等多種內(nèi)臟功能的調(diào)控，也是心血管壓力感受性反射的第一級(jí)感覺中繼站［10－12］。在血壓的調(diào)節(jié)過(guò)程中，NTS與迷走神經(jīng)背核、延髓頭端腹外側(cè)核（rostralventrolateralmedulla，rVLM）、延髓尾端腹外側(cè)核（caudalventrolateralmedulla，cVLM）、疑核等中樞核團(tuán)有纖維聯(lián)系，通過(guò)交感和副交感神經(jīng)傳出通路完成對(duì)血壓的調(diào)節(jié)［13］。還有研究表明，不同軀體部位及耳針刺激信息的傳入，通過(guò)間接和直接的途徑到達(dá)NTS進(jìn)行匯聚［14－16］。我們認(rèn)為針刺信號(hào)可以通過(guò)影響NTS中特定的與血壓調(diào)節(jié)有關(guān)的神經(jīng)元，以體表－心血管反射的形式完成對(duì)血壓的調(diào)控。但對(duì)于NTS中與血壓調(diào)節(jié)有關(guān)神經(jīng)元的鑒別及機(jī)體不同血壓狀態(tài)下針刺效應(yīng)的同步研究，目前尚不多見。本實(shí)驗(yàn)擬觀察不同穴位電針對(duì)麻醉大鼠血壓的影響，同步記錄NTS細(xì)胞外電活動(dòng)，探討針刺在不同血壓狀態(tài)下的降壓作用，闡明NTS升壓反射相關(guān)神經(jīng)元在針刺降壓過(guò)程中的變化特點(diǎn)，以深入探討針刺降壓的中樞機(jī)制。

1材料與方法

1．1動(dòng)物健康成年Sprague－Dawley雄性大鼠（250～350g）47只，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2009－0017，飼養(yǎng)于12h光照／12h黑暗的環(huán)境中，自由飲水和攝食。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置遵照科技部的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定。

1．2主要試劑與儀器脫羥腎上腺素（Phenylephrine，PE，Sigma）；立體定位儀（SR－6R，日本光電），推進(jìn)器（DMA－1510，美國(guó)），微電極放大器（Model1800，美國(guó)），Micro1401mR生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)（CED，英國(guó)），BIOPAC（MP150多道生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)，美國(guó)），微量注射泵（ALC－IP800，上海奧爾科特生物科技有限公司），刺激器（SEN－7203，日本光電），隔離器（SS102J，日本光電），動(dòng)物恒溫系統(tǒng)（ALC－HIP，上海奧爾科特生物科技有限公司），玻璃微電極拉制儀（ModelP－97，美國(guó)），針灸針（0．25mm×30mm，蘇州醫(yī)療用品廠），冰凍切片機(jī)（Thermo，MicromInternationalGmbH，德國(guó)）。

1．3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備大鼠用10％烏拉坦（1．0～1．2g／kg）腹腔注射麻醉。手術(shù)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物體溫用恒溫儀維持在37℃左右。動(dòng)物行頸靜脈、頸動(dòng)脈、氣管插管術(shù)后，動(dòng)脈插管通過(guò)三通與注射器和壓力傳感器相連，實(shí)時(shí)記錄及監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓（meanarterialpressure，MAP）的變化，注射器內(nèi)留置2mL200U／mL的肝素，以防血管堵塞。靜脈插管直接與注射器相連，以備靜脈用藥。動(dòng)物俯臥，將大鼠頭部用耳棒固定于立體定位儀上，暴露小腦后端及延髓。在顯微鏡下剝離軟腦膜，暴露的腦組織用溫的石蠟油覆蓋。以立體定位儀確定NTS坐標(biāo)位置：閂部上下1．0mm，中線旁開0～1．0mm，深度0．3～0．8mm。在手術(shù)顯微鏡下插入玻璃微電極至延髓表面，隨即以石蠟油覆蓋以防止干燥及減少延髓波動(dòng)對(duì)微電極位置的影響。玻璃微電極在P－97微電極拉制儀上拉制，尖端直徑1μm左右，測(cè)定微電極直流電阻應(yīng)為10～15MΩ，記錄前灌沖2．0％醋酸滂胺天藍(lán)電極液。

1．4實(shí)驗(yàn)記錄同步記錄NTS神經(jīng)元放電及MAP，在微電極推進(jìn)器下，以2μm／s的速度推進(jìn)玻璃微電極，在0．3～0．8mm深度之間尋找放電穩(wěn)定的神經(jīng)元；在此基礎(chǔ)上經(jīng)靜脈注入PE（4μg／kg），以鑒定該神經(jīng)元對(duì)MAP上升的反應(yīng)。MAP升高超過(guò)10mmHg（1mmHg≈0．133kPa）、NTS神經(jīng)元放電頻率增加或減少15％即界定為血壓相關(guān)神經(jīng)元。待NTS神經(jīng)元自發(fā)放電穩(wěn)定、MAP恢復(fù)至正常后，記錄30s放電脈沖數(shù)作為對(duì)照值，然后電針耳穴“心”及體穴“內(nèi)關(guān)”“足三里”各30s，各穴電針時(shí)間間隔至少在5min以上。為排除針刺穴位順序?qū)ι窠?jīng)元放電結(jié)果的影響，穴位隨機(jī)排序，觀察電針對(duì)MAP及NTS神經(jīng)元放電的影響。以0．2mL／min（2μg／mL）的速度在大鼠頸靜脈微量注射PE（6～12μg／kg，維持15～30min）造成藥物性血壓升高超過(guò)15mmHg及以上。在升壓平臺(tái)期再分別電針上述穴位，并觀察其對(duì)MAP和NTS神經(jīng)元放電的影響。神經(jīng)元放電的信號(hào)經(jīng)微電極放大器放大，MAP信號(hào)經(jīng)BIOPAC轉(zhuǎn)化為電信號(hào)后輸入Micro1401mR生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)，SPIKE2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。神經(jīng)元放電記錄結(jié)束后，用刺激器通過(guò)隔離器經(jīng)微電極放大器向玻璃微電極通以20μA的陰極直流電20min，將玻璃微電極內(nèi)2％的醋酸滂胺天藍(lán)電極液導(dǎo)入腦組織以標(biāo)記記錄位置。灌流切片后確認(rèn)正確的記錄位點(diǎn)，位置不符合者數(shù)據(jù)不納入統(tǒng)計(jì)。

1．5穴位定位及電針刺激按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［17］選穴。左“足三里”穴在左腓骨小頭下約5mm處；左“內(nèi)關(guān)”穴在左前肢1／6折點(diǎn)處外側(cè)，橈、尺骨縫中；左耳穴“心”在耳甲腔中央。電針強(qiáng)度2mA，頻率10Hz，波寬500ms，參考電極放在穴位旁開0．5mm處。

1．6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理血壓數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x珚±sx珔）表示，針刺前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，均以P＜0．05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)本研究組以往對(duì)NTS神經(jīng)元自發(fā)放電的研究，以刺激前后放電頻率超過(guò)15％作為標(biāo)準(zhǔn)，神經(jīng)元對(duì)針刺的反應(yīng)分為興奮、抑制和無(wú)反應(yīng)，刺激后頻率變化增加15％判斷為升壓反射相關(guān)神經(jīng)元。神經(jīng)元對(duì)刺激反應(yīng)的分類個(gè)數(shù)屬計(jì)數(shù)資料，神經(jīng)元放電變化表示為增加百分比，組間變化率的比較采用LSD分析。以上數(shù)據(jù)輸入SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2．1NTS與升壓反射有關(guān)的神經(jīng)元的鑒別麻醉大鼠頸靜脈注射PE后，在記錄動(dòng)脈血壓升壓反射的同時(shí)，分辨并完整地記錄到67個(gè)NTS神經(jīng)元細(xì)胞外放電，其中15個(gè)細(xì)胞（22．39％）放電頻率增加，呈興奮反應(yīng)，放電頻率的凈增加率為（63．59±13．21）％；36個(gè)神經(jīng)元（53．73％）放電頻率無(wú)變化；16個(gè)神經(jīng)元（23．88％）放電頻率減少，呈抑制反應(yīng)，放電頻率的凈降低率為（49．28±11．50）％。

2．2電針作用于耳穴“心”及體穴“內(nèi)關(guān)”“足三里”對(duì)大鼠生理狀態(tài)下MAP及NTS神經(jīng)元放電的影響如圖1所顯示的單個(gè)例子，電針耳穴“心”和體穴“足三里”能夠明顯降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的MAP，與此同時(shí)，NTS與升壓反射相關(guān)神經(jīng)元的放電明顯增加；電針“內(nèi)關(guān)”雖然也能輕度激活NTS神經(jīng)元放電，但對(duì)MAP沒有明顯影響。正常大鼠的MAP范圍為82～120mmHg。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（圖2），生理血壓狀態(tài)下，電針耳穴“心”使動(dòng)物的MAP由原來(lái)的（100．11±3．30）mmHg下降為（88．47±3．75）mmHg，下降了（11．64±0．45）mmHg（P＜0．001）；電針“足三里”使MAP下降了（5．74±0．64）mmHg（P＜0．001）；電針“內(nèi)關(guān)”對(duì)MAP無(wú)顯著影響（P＞0．05）。不同穴位組間降壓效應(yīng)比較顯示，電針耳穴“心”和體穴“足三里”對(duì)MAP的影響大于“內(nèi)關(guān)”（P＜0．05）。針刺不同穴位引起MAP變化的同時(shí)，對(duì)生理MAP狀態(tài)下NTS與升壓反射相關(guān)神經(jīng)元的放電頻率的影響以興奮性為主。對(duì)升壓反射有興奮性反應(yīng)的15個(gè)神經(jīng)元待MAP恢復(fù)至生理狀態(tài)時(shí)，電針大鼠耳穴“心”，8個(gè)放電頻率增加［凈增加率為（115．20±15．25）％］，7個(gè)放電頻率無(wú)變化或減少；電針“內(nèi)關(guān)”穴，7個(gè)神經(jīng)元放電頻率增加［凈增加率為（54．24±6．89）％］，8個(gè)放電頻率無(wú)變化或減少；電針“足三里”穴，7個(gè)神經(jīng)元放電頻率增加［凈增加率為（103．35±14．78）％］，8個(gè)放電頻率無(wú)變化或減少。組間比較結(jié)果顯示，電針耳穴“心”和“足三里”兩個(gè)穴位對(duì)神經(jīng)元激活增加的百分比較“內(nèi)關(guān)”穴顯著增高（P＜0．05）。見圖3。

2．3電針作用于耳穴“心”及體穴“內(nèi)關(guān)”“足三里”對(duì)PE引起MAP升高狀態(tài)大鼠MAP和NTS神經(jīng)元放電的影響在大鼠頸靜脈注射PE造成藥物性升壓模型，MAP由生理的（99．28±3．82）mmHg，上升并維持在（121．66±2．91）mmHg。如圖4所顯示的單個(gè)例子，電針耳穴“心”和體穴“足三里”能夠明顯降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物升壓平臺(tái)期的MAP，與此同時(shí)，NTS與升壓反射相關(guān)神經(jīng)元的放電明顯增加；電針“內(nèi)關(guān)”雖然也能輕度激活NTS神經(jīng)元放電，但對(duì)MAP沒有明顯影響。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（圖5），在PE引起的升壓平臺(tái)期，電針耳穴“心”使動(dòng)物的MAP由原來(lái)的（124．17±4．43）mmHg下降到（118．70±3．64）mmHg，下降了（8．30±0．79）mmHg（P＜0．001）；電針“足三里”使MAP下降了（6．07±0．79）mmHg（P＜0．05）；電針“內(nèi)關(guān)”對(duì)MAP無(wú)明顯影響（P＞0．05）。組間比較顯示，電針耳穴“心”和體穴“足三里”的降壓效應(yīng)好于“內(nèi)關(guān)”（P＜0．05）。比較同一穴位電針對(duì)麻醉大鼠生理狀態(tài)和PE引起血壓升高狀態(tài)下MAP的影響，結(jié)果表明兩種狀態(tài)下MAP的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。電針不同穴位引起升壓平臺(tái)期MAP變化的同時(shí)，對(duì)NTS與升壓反射相關(guān)神經(jīng)元的放電頻率的影響以興奮性為主。對(duì)升壓反射有興奮性反應(yīng)的15個(gè)神經(jīng)元中，電針耳穴“心”，9個(gè)放電頻率增加［凈增加率為（92．94±10．42）％］，6個(gè)放電頻率無(wú)變化或減少；電針“內(nèi)關(guān)”穴，9個(gè)神經(jīng)元放電頻率增加［凈增加率為（44．66±6．27）％］，6個(gè)放電頻率無(wú)變化或減少；電針“足三里”穴，8個(gè)神經(jīng)元放電頻率增加［凈增加率為（86．73±5．57）％］，7個(gè)放電頻率無(wú)變化或減少。組間比較結(jié)果顯示，電針耳穴“心”和“足三里”兩個(gè)穴位對(duì)神經(jīng)元激活增加的百分比較“內(nèi)關(guān)”穴顯著增高（P＜0．05）。見圖6。

3討論

頸動(dòng)脈竇和主動(dòng)脈弓壓力感受器反射是交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)通過(guò)上位中樞調(diào)節(jié)MAP的重要途徑［18］。這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)形式在一定血壓范圍內(nèi)比較敏感（100mmHg左右），且調(diào)定點(diǎn)隨動(dòng)脈血壓狀態(tài)可以重新調(diào)定。如高血壓時(shí)調(diào)定點(diǎn)上移，壓力反射調(diào)節(jié)可以在血壓較高水平上工作［19］。交感神經(jīng)活動(dòng)過(guò)度興奮和動(dòng)脈血壓調(diào)定點(diǎn)上移是高血壓病的主要病理機(jī)制［20］。與血壓調(diào)節(jié)有關(guān)的中樞主要包括下丘腦弓狀核、rVLM、cVLM、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū)、蒼白球、脊髓背角和中間外側(cè)部［21］。NTS是內(nèi)臟感覺傳入到上位中樞的第一級(jí)中繼站，和rVLM之間有著雙向的纖維投射［22］，電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)也證明NTS存在對(duì)血壓反射敏感的神經(jīng)元［23］。壓力感受器傳入首先投射到NTS神經(jīng)元，由此直接或間接與血壓感受反射的迷走傳出（疑核）和交感傳出（通過(guò)rVLM和cVLM的神經(jīng)元）中樞聯(lián)系，調(diào)節(jié)心血管功能狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)血壓［24］。Zhang等［25］對(duì)麻醉大鼠的研究表明，NTS內(nèi)存在對(duì)升壓反射敏感的神經(jīng)元，但不對(duì)血壓的絕對(duì)升高有持續(xù)反應(yīng)，動(dòng)脈血壓高水平范圍內(nèi)的自穩(wěn)調(diào)節(jié)是多種傳入編碼的結(jié)果，而不是由單個(gè)神經(jīng)元階梯狀放電的變化介導(dǎo)的。NTS接受主動(dòng)脈減壓神經(jīng)（ADN）傳入的神經(jīng)元大多數(shù)對(duì)血壓的增加產(chǎn)生興奮性的反應(yīng)，我們的研究可能既包含了ADN傳入的NTS神經(jīng)元，也包含了有自發(fā)放電但與ADN激活無(wú)關(guān)的NTS神經(jīng)元，NTS神經(jīng)元對(duì)PE引起的升壓反射既有興奮性反應(yīng)也有抑制性反應(yīng)，但以興奮性反應(yīng)為主。本研究組及其他研究組前期工作表明，麻醉大鼠在生理血壓狀態(tài)下，刺激與心交感神經(jīng)支配同節(jié)段的“內(nèi)關(guān)”穴，主要引起交感神經(jīng)興奮效應(yīng)，通常不產(chǎn)生降壓作用，而刺激與心異神經(jīng)節(jié)段的“足三里”穴能抑制交感神經(jīng)功能引起降壓效應(yīng)［26］。也有人認(rèn)為，電針“足三里”能抑制NTS內(nèi)側(cè)亞核P物質(zhì)的釋放并且能夠激活c－fos基因在中樞延髓和背核中的表達(dá)，即電針“足三里”穴可以增強(qiáng)迷走中樞的興奮性［27］。耳穴由于有迷走神經(jīng)耳支的支配，也引起穩(wěn)定的降壓效應(yīng)。如高昕妍等［2，28］的研究表明，針刺“耳甲”激活副交感神經(jīng)電活動(dòng)能降低大鼠血壓，此降壓效應(yīng)與迷走神經(jīng)中樞功能與結(jié)構(gòu)的完整密切相關(guān)，特別是與NTS中心功能相關(guān)神經(jīng)元的激活有關(guān)。自發(fā)性高血壓大鼠的實(shí)驗(yàn)研究表明，針刺耳穴“心”能引起比正常大鼠更顯著的降壓作用［2］。而本研究藥物引起的血壓升高平臺(tái)期（平均120mmHg）與自發(fā)性高血壓大鼠的基礎(chǔ)平均血壓（180mmHg）有明顯不同。另外，PE作為腎上腺素能α受體激動(dòng)劑，使周圍與交感神經(jīng)α受體有關(guān)的功能均上調(diào)，如：使除冠狀動(dòng)脈以外的小動(dòng)脈強(qiáng)烈收縮，引起外周阻力明顯增大而引起血壓升高等［29］。因而本實(shí)驗(yàn)中針刺對(duì)血壓升高大鼠的降壓幅度與正常大鼠差異不明顯。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合以往研究，我們認(rèn)為針刺耳穴“心”和體穴“足三里”在生理狀態(tài)和藥物引起血壓升高狀態(tài)下都有一定降壓作用，這種降壓效果與NTS中升壓反射敏感神經(jīng)元的同步放電有關(guān)，這些升壓反射相關(guān)神經(jīng)元對(duì)針刺的反應(yīng)以激活為主，并且存在一定的穴位特異性。