基因座法醫(yī)學(xué)采集探究范文

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作者：姜先華賈菲趙金玲沈紅纓陳初光金萍郭飛李秋陽(yáng)邵武于蛟單位：遼寧省刑事科學(xué)技術(shù)研究所基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)有限公司中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院

復(fù)合擴(kuò)增體系的建立和優(yōu)化

建立20個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系，并進(jìn)行調(diào)整、優(yōu)化實(shí)驗(yàn):引物濃度設(shè)置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。引物退火溫度設(shè)置梯度(56、57、58、59、60、61、62℃)。緩沖液濃度設(shè)置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。

模板濃度以9947A標(biāo)準(zhǔn)品DNA(10ng/μL)為模板，設(shè)置梯度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5ng)。PCR循環(huán)次數(shù)在以上確定的最佳引物濃度、退火溫度、緩沖液濃度、DNA濃度條件下，設(shè)置PCR循環(huán)次數(shù)梯度(27、28、29、30、31、32)。

PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

采用ABI3130XL型遺傳分析儀及GeneMapper3.2軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和分型。編制與復(fù)合擴(kuò)增體系中的基因座相對(duì)應(yīng)Panel和與等位基因數(shù)據(jù)項(xiàng)對(duì)應(yīng)Bin，導(dǎo)入GeneMapper3.2軟件用于分析判型。

擴(kuò)增體系指標(biāo)驗(yàn)證及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

1擴(kuò)增體系技術(shù)指標(biāo)驗(yàn)證

一致性368份無(wú)關(guān)個(gè)體血樣采用TECAN工作站磁珠法提取DNA，STR分型結(jié)果與SinofilerTM和PowerPlex16分型結(jié)果進(jìn)行一致性和成功率比較。靈敏度采用美國(guó)Promega公司的9947ADNA(10ng/μL)進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。模板定量為2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng進(jìn)行檢測(cè)，平行重復(fù)3次。種屬特異性設(shè)置人源性和非人源性檢材(豬、雞、魚)，測(cè)試方法的種屬特異性。

2案件檢材應(yīng)用

血斑、混合斑、汗液斑、唾液斑、肋軟骨、肌肉組織和毛發(fā)樣本，經(jīng)Chelex100法提取DNA，采用本文方法檢測(cè)，與SinofilerTM和PowerPlex16分型結(jié)果比對(duì)。

結(jié)果與討論

1檢測(cè)方法及遺傳學(xué)調(diào)查

本文最終選擇的五色熒光復(fù)合擴(kuò)增總體系10μL，內(nèi)含:模板DNA0.5ng、2.5×PCR緩沖液4μL、5×引物混合物2μL、GoldTaq1U0.2μL。PCR循環(huán)參數(shù)為:95℃5min;94℃30s、60℃1min、70℃1min，共30次循環(huán);最后60℃延伸30min。電泳檢測(cè):取1μLPCR產(chǎn)物、8.5μL去離子甲酰胺、0.5μLORANGE500分子量?jī)?nèi)標(biāo)，混勻，95℃變性3min，立即冰浴;使用ABI3130XL型遺傳分析儀電泳分離，毛細(xì)管36cm，“DyeSet”選擇“E5”。采用GeneMapperIDv3.2軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，本方法可對(duì)所選20個(gè)基因座成功分型，且均衡性良好，峰型對(duì)稱尖銳、無(wú)雙肩峰等雜峰。

應(yīng)用本文方法對(duì)368份無(wú)關(guān)個(gè)體血痕樣本進(jìn)行檢測(cè)，19個(gè)STR基因座數(shù)據(jù)采用直接計(jì)數(shù)法和PowerStatsV12軟件(www．promega．com)進(jìn)行遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明:各基因座基因型觀察值和期望值之間無(wú)顯著差異，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。19個(gè)STR基因座的等位基因及其頻率以及相關(guān)遺傳學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2、3。從表2、3可見(jiàn)，除D3S1358、CSF1PO、TPOX、TH014個(gè)基因座外均為高雜合度(H＞0.7)、高識(shí)別能力(DP＞0.9)和高信息量(PIC＞0.7)基因座。本方法累積個(gè)人識(shí)別能力為0.999999999999999999999，高于IdentifilerTM和PowerPlex16，累積非父排除率為0.99999999，可為法庭科學(xué)DNA分析工作提供更加準(zhǔn)確的判斷依據(jù)，且可做到一次檢測(cè)獲得更多信息，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)和實(shí)際案件有重要意義。

2方法指標(biāo)驗(yàn)證

一致性368份無(wú)關(guān)個(gè)體血樣經(jīng)該方法檢測(cè)得到的分型與SinofilerTM和PowerPlex16相同基因座的分型結(jié)果完全一致，說(shuō)明該檢測(cè)方法具有良好的準(zhǔn)確性和一致性。靈敏度經(jīng)對(duì)不同模板量進(jìn)行檢測(cè)，最佳模板量為0.125～1.0ng，峰高均值在500～2000Rfu之間。

模板量低至0.0625ng仍可獲得完整STR分型結(jié)果，但峰值小于100Rfu，亦可出現(xiàn)雜合子峰高不均衡現(xiàn)象。模板量為2.0ng時(shí)，峰值達(dá)6000Rfu，易出現(xiàn)拔起峰及雜峰，影響結(jié)果判讀(圖1)種屬特異性采用本文方法檢測(cè)豬、魚、雞的DNA樣品，結(jié)果與IdentifilerTM所報(bào)道的種屬特異性檢測(cè)結(jié)果一致。魚和雞樣品結(jié)果為陰性，豬樣品圖譜分型區(qū)內(nèi)均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，僅在性別位點(diǎn)前出現(xiàn)103bp非特異性擴(kuò)增峰，但不影響人源DNA判型(圖2)。結(jié)果表明本文方法具有良好的種屬特異性。

3實(shí)際案例檢材應(yīng)用

55份案例檢材經(jīng)Chelex100法提取DNA，采用本文方法進(jìn)行分型檢測(cè)，與SinofilerTM和PowerPlex16結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，各基因座均獲得一致的分型結(jié)果。當(dāng)檢材為低拷貝模板時(shí)，可獲得的基因座數(shù)量更多。例如某案例的甲醛固定石蠟包埋樣本，采用本文方法和SinofilerTM使用相同模板量及電泳參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，本文方法得到10個(gè)基因座的分型，而SinofilerTM僅得到7個(gè)基因座的分型，且前者平均峰高高于后者(圖3)。

綜上，本文建立的五色熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系，可對(duì)生物檢材20個(gè)基因座進(jìn)行檢測(cè)，其個(gè)體識(shí)別能力、非父排除能力、檢測(cè)靈敏度和檢材適用性等均可達(dá)到當(dāng)前商品化試劑盒的檢測(cè)水平，為法醫(yī)DNA分析檢測(cè)提供了新方法，并因其可檢測(cè)到更多基因座，故在提高數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)中具有巨大應(yīng)用潛力。