白血病小鼠模型的建立及鑒定范文

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【摘要】目的:建立BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病小鼠模型，為研究白血病的發(fā)病機制和藥物開發(fā)提供理想的平臺．方法:利用含有pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染6～10周齡C57BL/6供者小鼠的骨髓細(xì)胞，移植給致死量射線照射的同種同型受者小鼠，建立BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病小鼠模型;監(jiān)測移植小鼠的體質(zhì)量，生存率;流式細(xì)胞儀檢測小鼠外周血有核細(xì)胞GFP表達(dá)(代表有核細(xì)胞表達(dá)BCR/ABL1)和細(xì)胞分型;觀察小鼠脾臟、肺臟和肝臟等器官大體形態(tài)和HE染色變化．結(jié)果:移植20d后，移植小鼠呈現(xiàn)弓背、活動性減少、精神萎靡的狀態(tài)，體質(zhì)量明顯降低;流式細(xì)胞儀檢測外周血中出現(xiàn)GFP+細(xì)胞，并且隨著移植時間的延長，GFP+粒細(xì)胞明顯增多．移植小鼠的生存率較對照組明顯降低．移植小鼠發(fā)病后呈現(xiàn)脾臟顯著增大、肺出血、肺臟及肝臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)和HE染色呈現(xiàn)大量細(xì)胞浸潤，且小鼠脾臟中有核細(xì)胞的80%為GFP+Gr-1+細(xì)胞，即BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病細(xì)胞．結(jié)論:利用此方法成功建立了BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病小鼠模型，為研究慢性粒細(xì)胞白血病機制和治療提供了平臺．

【關(guān)鍵詞】BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病;BCR-ABL1;小鼠;生存率;逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

0引言

慢性粒細(xì)胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)是一種以粒細(xì)胞失去分化能力，過度增殖為特征的骨髓增生性疾病，是一種伴有t(9;22)(q34;q11)染色體易位的惡性增生性疾?。?］．該易位染色體由位于9號染色體的原癌基因ABL1部分序列從其正常位置易位至22號染色體的BCR區(qū)(breakpointclusterregion，BCR)形成［2］，其編碼的蛋白具有高度異常酪氨酸激酶活性，造成了CML細(xì)胞對酪氨酸激酶抑制劑的抵抗［3］．因此，研究CML的發(fā)病機制和治療藥物顯得尤為重要，而一個良好的實驗平臺是研究機制和藥理的基礎(chǔ)．研究［4－5］發(fā)現(xiàn)，雖然我們可以利用將CML患者的白血病細(xì)胞移植給NOD/SCID小鼠構(gòu)建的小鼠模型來研究白血病細(xì)胞是否導(dǎo)致并維持了CML，但是這種模型不能造成致死性CML且耗時較長;而BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠模型由于不能完全發(fā)展成為髓系增生性疾病且具有潛伏期長的局限性，不利于治療藥物的研究［4－5］．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染骨髓細(xì)胞的移植模型則是一種穩(wěn)定高效的誘導(dǎo)方式［6］，可以為研究CML的發(fā)病機制和治療藥物提供幫助．本研究在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染骨髓細(xì)胞移植模型的基礎(chǔ)上建立了更加省時、高效且易于監(jiān)測病程和鑒定疾病類型的方式，成功建立了容易監(jiān)測及鑒定的BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病小鼠模型，為CML的機制和藥物研究提供了一個良好的平臺．

1資料和方法

1．1材料

1．1．1載體和試劑

pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP、pkat-ampac逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝載體由本實驗室保存．5-Fluorouracil(5-Fu，Cat#6627)、HEPES和polybrene來自Sigma．抗小鼠Gr-1-APC(Cat#553129)流式抗體來自BD．SCF、IL-3、IL-6來自Peprotech．

1．1．2實驗動物

6～10周齡的C57BL/6小鼠購買并飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級動物房．

1．2方法

1．2．1pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備

用293T細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液含有10%FBS、1%青鏈霉素，200mM谷氨酸和1%MEMnon-essential氨基酸)將293T細(xì)胞于10cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)至密度為80%時，利用pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后收集pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液立即使用或儲存－80．

1．2．2采集和體外培養(yǎng)供者小鼠骨髓細(xì)胞

要求供者和受者小鼠屬于同一品系．通常情況下，10只供者小鼠可提供2～3107骨髓細(xì)胞．第1天，取6～10周齡SPF級C57BL/6小鼠20只，尾靜脈注射0．6mL5-Fu/只，按200mg/kg計算．第4天時，處死小鼠獲取4～6107骨髓細(xì)胞，將供者骨髓細(xì)胞分為兩等分，即實驗組和對照組，用48mL骨髓細(xì)胞刺激培養(yǎng)基(含有77%DMEM，20%FBS，1%青鏈霉素，200mM谷氨酸，18ng/mL小鼠重組IL-3，20ng/mL小鼠重組IL-6以及100ng/mL小鼠重組SCF)分別懸于兩個六孔板中，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h．

1．2．3pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒感染供者小鼠骨髓細(xì)胞

第5天，向?qū)嶒灲M的六孔板加入pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒第一次轉(zhuǎn)染骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基(含有50%pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，18ng/mL小鼠重組IL-3，20ng/mL小鼠重組IL-6，100ng/mL小鼠重組SCF，1%HEPES和20μg/mLpolybrene)，每孔2mL，對照組的六孔板加入骨髓細(xì)胞刺激培養(yǎng)基，每孔2mL，輕柔混勻后，室溫2300rpm離心90min，繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4h．室溫下1500rpm離心10min，丟棄上清液，各加入24mL骨髓細(xì)胞刺激培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)．第6天，向?qū)嶒灲M的六孔板加入pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒第二次轉(zhuǎn)染骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基(含有50%pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，18ng/mL小鼠重組IL-3，20ng/mL小鼠重組IL-6，100ng/mL小鼠重組SCF，1%HEPES和20μg/mLpolybrene)，每孔2mL，懸浮第一次轉(zhuǎn)染后的骨髓細(xì)胞，向?qū)φ战M的六孔板加入骨髓細(xì)胞刺激培養(yǎng)基，每孔2mL，輕柔混勻后，室溫2300rpm離心90min，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h．最后用Hank's緩沖液懸浮兩組骨髓細(xì)胞，準(zhǔn)備注射受者小鼠．

1．2．4致死量射線照射受者小鼠并進(jìn)行骨髓移植

第6天，采用醫(yī)用電子直線加速器(英國Eiekta)照射6～10周齡SPF級的C57BL/6小鼠12只，輻射劑量920cGy．將上述pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后的供者小鼠骨髓細(xì)胞，尾靜脈注射給6只受照射后的受者小鼠作為實驗組，同樣，將未使用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后的供者小鼠骨髓細(xì)胞，尾靜脈注射給6只受照射后的受者小鼠作為對照組，細(xì)胞用量為1106/0．4mL/只．SPF級動物房飼養(yǎng)移植后小鼠．每隔一天觀察小鼠存活情況、稱取體質(zhì)量;每周采用流式細(xì)胞儀檢測受者小鼠外周血GFP陽性細(xì)胞數(shù)量，即代表表達(dá)BCR-ABL1的細(xì)胞．大約15～20d可建立BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病小鼠模型．

1．2．5BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病小鼠模型的鑒定

1．2．5．1移植小鼠體質(zhì)量和生存率監(jiān)測

每隔一天稱取并記錄實驗組小鼠和對照組小鼠的體質(zhì)量，計算實驗組小鼠和對照組小鼠的生存率．

1．2．5．2流式細(xì)胞儀檢測

每周取移植受者小鼠內(nèi)眥血于抗凝劑中，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解8min去掉紅細(xì)胞后，1PBS洗2次，檢測外周血有核細(xì)胞中GFP+白血病細(xì)胞的百分比并計數(shù)．將瀕死的移植受者小鼠處死后觀察小鼠脾臟，盡快收集病鼠的骨髓細(xì)胞及脾臟細(xì)胞，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解5min去掉紅細(xì)胞后，1PBS洗2次，利用抗小鼠Gr-1抗體對移植受者小鼠的骨髓和脾臟細(xì)胞避光孵育20min，1PBS洗2次，1PBS懸起后流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)行免疫分型．以Gr-1+GFP+表示粒細(xì)胞白血病細(xì)胞．

1．2．5．3移植受者小鼠肺臟和肝臟HE染色

將瀕死的移植受者小鼠處死后觀察小鼠肺臟和肝臟，將肺臟和肝臟組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，切片和HE染色后，顯微鏡下觀察白血病細(xì)胞的浸潤情況．

2結(jié)果

2．1移植小鼠體質(zhì)量和生存率變化

將pMSCV-BCR/ABL1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后的C57BL/6供者小鼠骨髓細(xì)胞，尾靜脈注射給受照射后的C57BL/6受者小鼠作為實驗組，以接受同樣劑量照射并移植未感染病毒的供者骨髓細(xì)胞的C57BL/6受者小鼠作為對照組，每隔一天稱取體質(zhì)量，監(jiān)測小鼠體質(zhì)量變化．由于致死量照射，移植后的C57BL/6小鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)照射性降低，隨后在一周之內(nèi)恢復(fù)體質(zhì)量并且持續(xù)平穩(wěn)，在移植后3周時，實驗組小鼠體質(zhì)量連續(xù)降低，而對照組小鼠體質(zhì)量保持平穩(wěn)(圖1A)，C57BL/6實驗組小鼠與C57BL/6對照組小鼠的體質(zhì)量變化比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)．

2．2移植小鼠外周血白血病細(xì)胞監(jiān)測情況

C57BL/6受者小鼠接受供者的小鼠骨髓細(xì)胞后，每周取移植受者小鼠內(nèi)眥血，監(jiān)測受者小鼠外周血中GFP+白血病細(xì)胞的水平．通過流式細(xì)胞儀檢測后發(fā)現(xiàn)，C57BL/6實驗組小鼠7d后外周血中即出現(xiàn)GFP+細(xì)胞(圖2A)，并且隨著移植時間推移，GFP+粒細(xì)胞明顯增多(圖2B)．至白血病細(xì)胞占外周血有核細(xì)胞80%時，小鼠迅速死亡．C57BL/6對照組小鼠外周血中始終未出現(xiàn)GFP+細(xì)胞．

2．3移植小鼠粒細(xì)胞白血病建模成功

骨髓移植20d左右時，實驗組小鼠呈現(xiàn)弓背、活動性減少、精神萎靡、進(jìn)食減少的狀態(tài)(圖3A)．當(dāng)實驗組小鼠體質(zhì)量連續(xù)減輕且外周血白血病細(xì)胞持續(xù)增高時，處死實驗組小鼠和對照組小鼠，觀察肺臟、脾臟及肝臟，發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠脾臟較對照組體積增大顯著，且出現(xiàn)肉眼可見大小不一數(shù)個白色突起(圖3B)，實驗組小鼠肺臟呈現(xiàn)出血、粗糙且布滿白色點狀結(jié)節(jié)(圖3C)，肝臟布滿白色結(jié)節(jié)(圖3D)．將肺臟和肝臟進(jìn)行HE染色，觀察到實驗組小鼠肺臟和肝臟有大量白細(xì)胞浸潤(圖3E、3F)．將脾臟進(jìn)行HE染色，同樣觀察到實驗組小鼠脾臟有大量白血病細(xì)胞浸潤(圖3G)，收集實驗組小鼠的骨髓細(xì)胞及脾臟細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)脾臟中主要為大細(xì)胞(圖3H)，且脾臟中GFP+細(xì)胞占有核細(xì)胞的90%(圖3I)，利用抗小鼠Gr-1抗體對實驗組小鼠的骨髓和脾臟細(xì)胞進(jìn)行免疫分型(以Gr-1+GFP+表示粒細(xì)胞白血病細(xì)胞)，通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)脾臟中有核細(xì)胞的80%為GFP+Gr-1+細(xì)胞，進(jìn)一步證實是BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病.

3討論

CML是一種由于粒細(xì)胞大量增生卻失去分化能力的髓系增生性疾病，來源于造血干細(xì)胞并且由于含有致癌基因BCR-ABL而獲得增殖快速于正常造血干細(xì)胞的優(yōu)勢［7－8］，由于致癌基因產(chǎn)生的蛋白具有高度異常的酪氨酸激酶活性，持續(xù)活化其下游信號分子通路，促進(jìn)了CML細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力，造成CML細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［9］．在CML進(jìn)程中CML-BP(blasticphase)患者對酪氨酸激酶抑制性藥物、異體造血干細(xì)胞移植、或者聯(lián)合化療效果均較差，死亡率極高［10］．此外，相對于CML-CP(chronicphase)期，CML-BP期基因組的復(fù)雜性和異質(zhì)性均更高［11］．雖然酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼對CML的治療有革命性的突破，但是BCR-ABL1基因的突變產(chǎn)生了伊馬替尼的耐藥問題［12－13］．因此，研究BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病的發(fā)生、耐藥機制以及新的藥物對治療CML至關(guān)重要．雖然我們可以利用CML細(xì)胞異體移植小鼠模型和BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠模型來研究CML的發(fā)病機制，但是由于這些小鼠模型構(gòu)建潛伏期較長，均不利于CML治療藥物的研究．本研究利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染骨髓細(xì)胞的移植模型具有穩(wěn)定且潛伏期短的優(yōu)勢，在其基礎(chǔ)上對照射方式進(jìn)行了改進(jìn)，使得照射一次性成功，耗時大大縮短，為實驗過程節(jié)省了寶貴的時間;此外，本研究還利用流式細(xì)胞儀檢測外周血有核細(xì)胞中GFP+白血病細(xì)胞數(shù)來監(jiān)測整個病程周期，可以準(zhǔn)確地了解移植受者小鼠的移植成功率和病程進(jìn)展，為CML治療藥物的研究提供精確的控制窗口，使得便捷地觀測到藥物的治療效果成為可能．這種容易監(jiān)測及鑒定的BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病小鼠模型，可以為CML的機制和藥物研究提供極大的幫助．BCR-ABL1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染骨髓細(xì)胞移植模型可以誘導(dǎo)出3種疾病:類似于CML的髓系增生性疾病，急性淋巴細(xì)胞白血病以及單核細(xì)胞性白血病，表明BCR-ABL1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后的骨髓細(xì)胞呈現(xiàn)出一種混亂的造血方式［14－15］．

5-Fu為細(xì)胞周期特異性化療藥物，主要殺傷分裂期細(xì)胞，從而富集髓系多能干細(xì)胞，因此，本研究利用5-Fu處理供者小鼠的骨髓細(xì)胞，可以提高骨髓中髓系多能干細(xì)胞的百分比，使轉(zhuǎn)染效率極大提高，然后使用粒系干細(xì)胞所需的細(xì)胞因子培養(yǎng)供者骨髓細(xì)胞，能夠?qū)е滤柘蹈杉?xì)胞向粒系發(fā)展，最終發(fā)展為CML小鼠模型［16］．本研究利用細(xì)胞因子體外培養(yǎng)5-Fu處理后小鼠供者骨髓細(xì)胞，再利用BCR-ABL1-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒感染供者的骨髓細(xì)胞，并移植給致死量照射后的同種系受者小鼠，通過監(jiān)測受者小鼠的體質(zhì)量、生存率、流式細(xì)胞儀檢測受者小鼠外周血有核細(xì)胞表達(dá)GFP的情況來判定小鼠的病程進(jìn)展，簡單且高效，此外，利用抗小鼠Gr-1抗體對發(fā)病后的受者小鼠的骨髓和脾臟細(xì)胞進(jìn)行免疫分型，進(jìn)一步證實了BCR-ABL1+粒細(xì)胞白血病的小鼠模型建立成功，利用流式檢測技術(shù)可以高效地監(jiān)測整個建模過程，且容易判定模型類別．此外，通過觀察受者小鼠脾臟和肺臟等器官，我們發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞于肺臟和肝臟均有浸潤，這顯示我們的模型起源于骨髓造血干細(xì)胞且具有多器官浸潤的能力，這與人的CML較為相似，可以作為較理想的CML小鼠模型，為CML治療藥物的研究提供易觀測、易控制的平臺，為白血病的治療提供較大的幫助．

作者：張萍；李琛；鄭銘喆；張華；季延紅 單位：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)和免疫學(xué)系