白血病的DKK1基因研究范文
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白血病是一種造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，與表觀遺傳學(xué)的改變密切相關(guān)，其中關(guān)于DNA甲基化為當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一。由于大量研究表明白血病的發(fā)生與dkk1基因甲基化狀態(tài)有密切關(guān)系，因此我們就DKK1甲基化與白血病的研究進(jìn)行了綜述。DKK1基因與Wnt/β-catenin信號通路Dickkopf-1(DKK1)是Glinka等首次在兩棲動物非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種分泌型糖蛋白，屬于DKKs家族成員。人類的DKK1基因位于10q11，含有2個(gè)富含半胱氨酸的保守區(qū)域Cys1和Cys2，由266個(gè)氨基酸組成，其相對分子質(zhì)量在29kDa左右，N端經(jīng)糖基化修飾后其相對分子質(zhì)量在35kDa左右，目前確認(rèn)的結(jié)合受體有低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP-5與LRP-6)和跨膜蛋白(Kremen)受體兩類。研究揭示DKK1基因啟動子區(qū)域甲基化改變與多種疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，如乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌、腎細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病等。所謂基因甲基化是指DNA復(fù)制后，在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的介導(dǎo)下，催化腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到DNA分子中形成5-甲基胞嘧啶，從而生成甲基化的DNA。DKK1基因正常情況下其啟動子區(qū)域CpG島是處于非甲基化狀態(tài)的，一旦該區(qū)域出現(xiàn)了高甲基化，就會導(dǎo)致DKK1基因轉(zhuǎn)錄沉默。
大量研究表明，通過與Wnt信號通路上相應(yīng)的受體結(jié)合，DKK1對細(xì)胞的分化、增殖、遷移或癌變等特性進(jìn)行調(diào)控，在腫瘤發(fā)生方面發(fā)揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路參與胚胎發(fā)育及腫瘤形成，同時(shí)與造血系統(tǒng)發(fā)育、造血干細(xì)胞自我更新及某些惡性血液病密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞分泌的Wnt蛋白與細(xì)胞跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled)結(jié)合后，在輔助受體LRP-5/LRP-6的協(xié)同作用下，激活細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使胞質(zhì)內(nèi)散亂蛋白(dishevelled)發(fā)生磷酸化而活化。磷酸化的散亂蛋白抑制了GSK-3β的活性，使β-catenin不能與Axin-APC-GSK-3β等形成降解復(fù)合物，從而使胞漿內(nèi)游離的β-catenin蛋白積聚，進(jìn)入細(xì)胞核，與淋巴增強(qiáng)因子(lymphoid-en-hancingfactor，LEF)/T細(xì)胞因子(T-cellfactor，TCF)結(jié)合，形成β-catenin/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，使下游靶基因如C-MYC、cyclinD1等轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增高(附圖)，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。Mao等發(fā)現(xiàn)，DKK1作用通路是通過競爭Wnt蛋白結(jié)合LRP5/6受體而直接抑制Wnt蛋白活性，或通過含kringle結(jié)構(gòu)域的Kremen受體間接與LRP5/6受體結(jié)合，從而形成三聚體復(fù)合物，降低Wnt蛋白向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號，阻斷經(jīng)典Wnt/β-catenin/TCF傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，誘導(dǎo)其凋亡。
一、DKK1甲基化與急性白血病
急性白血病(acuteleukemia，AL)是一種與表觀遺傳學(xué)相關(guān)的疾病，具有多基因、遺傳學(xué)表型異質(zhì)性特點(diǎn)。大量研究表明，AL的發(fā)生與DKK1基因表達(dá)異常有密切關(guān)系。DKK1基因甲基化，引起基因表達(dá)下調(diào)或沉默，其抑制Wnt信號通路作用失活，導(dǎo)致Wnt信號通路激活，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生。Griffiths等［9］研究表明，在169名原發(fā)性AML患者中，89%的患者骨髓冰凍樣本或外周血組織樣本有1個(gè)以上的抑制基因發(fā)生甲基化，其中DKK1甲基化率為16%，且其甲基化與AML患者的不良預(yù)后存在相關(guān)性;在檢測的白血病細(xì)胞系(HL-60，K562，KG1，HNT34，KG1a，U937和HCT116)中至少50%的細(xì)胞都會發(fā)生DKK1甲基化。Valencia等［10］研究表明，在AML細(xì)胞系(kasumi-1，KGla，HL-60，THP-1)中DKK1基因都發(fā)生高甲基化，184例AML患者DKK1基因啟動子區(qū)域高甲基化狀態(tài)，甲基化發(fā)生率為32%。Suzuki等［11］研究發(fā)現(xiàn)，5例正常骨髓單核細(xì)胞樣本DKK1不發(fā)生甲基化，而47例AML患者骨髓樣本中DKK1甲基化率為29．8%，其中M2型病人更容易檢測到DKK1的甲基化，甲基化發(fā)生率為42．3%，10個(gè)伴t(8;21)染色體易位的AML患者中有5人發(fā)生DKK1甲基化。Raji、Molt-3和SK-NO-1細(xì)胞系均可觀察到DKK1甲基化，且多變量分析顯示DKK1甲基化是不良預(yù)后的一個(gè)危險(xiǎn)因素，與白血病的疾病進(jìn)展有關(guān)，但病人的5年總生存率與是否發(fā)生DKK1甲基化沒有明顯的相關(guān)性;研究還發(fā)現(xiàn)，RUNX1/RUNX1T1，CBFB-MYH11或者PML-RARA融合基因常與DKK1甲基化伴隨發(fā)生，均促進(jìn)白血病形成，而存在FLT3/ITD突變的11個(gè)AML患者沒有發(fā)現(xiàn)DKK1基因甲基化。這些結(jié)果顯示，F(xiàn)LT3/ITD突變可能不與DKK1甲基化同時(shí)發(fā)生。Hou等［12］發(fā)現(xiàn)，在269例AML患者中，166人有1個(gè)以上的Wnt抑制基因發(fā)生甲基化，其中DKK1甲基化率為30．1%。這些研究表明所有的Wnt抑制基因的異常甲基化導(dǎo)致的甲基化上調(diào)可能是Wnt抑制基因失活的主要機(jī)制。國內(nèi)朱珣珣等［13］研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，AL患者DKK1基因mRNA表達(dá)顯著降低，正常對照組單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本不存在DKK1的甲基化，但AL患者中DKK1甲基化率為37．7%，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者甲基化率為41．2%，AML患者中甲基化率為28．6%。一系列的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DKK1基因啟動子區(qū)域高甲基化，mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，DKK1蛋白表達(dá)降低，導(dǎo)致Wnt通路激活，從而引起AL的發(fā)生，且DKK1甲基化程度與病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)。
二、DKK1甲基化與慢性白血病
慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是具有Ph染色體和/或BCR-ABL融合基因陽性的造血干細(xì)胞惡性增殖性疾病。朱雅姝等［14］研究表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的DKK1可以抑制慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞K562的增殖。將DKK1基因用RNA干擾后與K562細(xì)胞共培養(yǎng)，可重新增加K562細(xì)胞Wnt信號通路中β-catenin表達(dá)，減弱對K562增殖的抑制作用。Zhu等［15］人研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的DKK1蛋白是Wnt信號通路強(qiáng)有力的抑制劑，可以抑制K562細(xì)胞增殖;當(dāng)DKK1基因被敲除或者使用抗體中和DKK1蛋白，DKK1對共培養(yǎng)的K562細(xì)胞的抑制作用則降低。Han等［16］研究表明，DKK1蛋白可以通過抑制Wnt信號通路，降低β-catenin含量，導(dǎo)致K562細(xì)胞凋亡增加，逆轉(zhuǎn)最終急變期CML的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對K562細(xì)胞的保護(hù)作用，使β-cate-nin水平降低。Filipovich等［17］研究發(fā)現(xiàn)，盡管Wnt信號通路在CLL中激活，而健康的B淋巴細(xì)胞和CLL細(xì)胞表達(dá)的DKK1基因mRNA及LRP6水平是等量的，在CLL中DKK1可能不發(fā)揮作用。然而Moskalev等［18］人研究表明，在CLL中DKK1甲基化水平明顯高于對照組，在EHEB和MEC-1細(xì)胞系中，DKK1甲基化發(fā)生率分別為68%和75%，12個(gè)CLL病人樣本中DKK1甲基化發(fā)生率為34%。研究結(jié)果的差異可能由于選擇的樣本影響或者樣本數(shù)量有限或者別的實(shí)驗(yàn)因素的影響，這需要進(jìn)一步研究證明。這些研究表明，不同類型的慢性白血病中DKK1所起的作用可能不同，這為以后更深入的研究DKK1基因在慢性白血病中的功能提供參考。
三、白血病去甲基化治療的新進(jìn)展
去甲基化藥物主要是指DNMT抑制劑。此類藥物在小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、白血病及骨髓增生異常綜合征等疾病中的應(yīng)用，獲得了顯著的療效。去甲基化藥物地西他濱(5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶，DAC)是一種天然的脫氧胞苷酸的腺苷類似物，特異性的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可逆轉(zhuǎn)DNA的甲基化過程，激活沉默失活的抑癌基因，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Moskalev等［18］研究表明，5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶在CLL細(xì)胞系中可以降低DKK1基因甲基化水平，然而并沒有導(dǎo)致明顯的DKK1基因的mRNA水平表達(dá)增加。Suzuki等［11］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AML細(xì)胞株(SKNO-1)使用5-氮雜-胞嘧啶治療4d后，觀察到DKK1基因表達(dá)恢復(fù)，這提示DKK1甲基化抑制了DKK1基因表達(dá)。Va-lencia等［10］研究表明，地西他濱治療AML后，DKK1基因的表達(dá)水平呈劑量依賴性增加。孟真等［19］研究發(fā)現(xiàn)，使用去甲基化藥物三氧化二砷后在原本不表達(dá)抑癌基因SHP-1mRNA的HL-60細(xì)胞中，SHP-1得到表達(dá)，而高表達(dá)的原癌基因C-kit表達(dá)水平下降。當(dāng)使用不同濃度的三氧化二砷作用后，SHP-1mRNA的表達(dá)水平呈劑量依賴性地上升，而C-kitmRNA的表達(dá)水平隨劑量增加而下降。雖然地西他濱在白血病的治療中取得了明顯療效，但由于使所有基因去甲基化，因此也有可能誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。目前的研究主要是靶向誘導(dǎo)DKK1去甲基化，這在白血病中還沒有新進(jìn)展，但在多發(fā)性骨髓瘤已取得一定的成果。如針對DKK1蛋白抑制成骨細(xì)胞激活破骨細(xì)胞而導(dǎo)致的溶骨性病變，可使用DKK1的中和抗體、蛋白酶體抑制劑、多肽疫苗免疫治療及調(diào)節(jié)因子等，這些方法均顯示出較好的療效［20］。另有研究表明，在結(jié)腸直腸癌中使用生物活性物質(zhì)維生素D3可以通過增加DKK1基因表達(dá)來調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路［21］。使用維生素D3(100nmol/L)治療結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株SW480-ADH，2d后腫瘤抑制基因DKK1表達(dá)增加，而致癌基因DKK4表達(dá)降低，其具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)，但這也為我們治療提供了一個(gè)方向，或許在白血病治療中也有一定的參考意義。
四、問題與展望
白血病作為一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤一直威脅到人類的健康，應(yīng)用去甲基化藥物治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。由于基因甲基化的異常改變通常先于腫瘤的發(fā)生，而腫瘤細(xì)胞壞死和凋亡產(chǎn)生的DNA又會游離到血漿、血清、痰、尿液等體液中，因此可以檢測這些體液中DKK1基因的甲基化情況，為腫瘤的早期診斷提供依據(jù)［22］。DKK1甲基化具有可逆性，因此去甲基化治療可以使其恢復(fù)表達(dá)，起到抗腫瘤作用。但目前去甲基化藥物治療存在一定的問題，首先是其缺乏特異的靶向性。因此，在恢復(fù)抑癌基因表達(dá)的同時(shí)可能引起原癌基因以及全基因組的低甲基化從而誘發(fā)腫瘤。其次，這類藥物具有可逆性，使用藥物可以暫時(shí)使DKK1基因去甲基化，但仍有可能恢復(fù)到高甲基化狀態(tài)，故需要長期持續(xù)應(yīng)用才可以達(dá)到一定的效果，而大劑量應(yīng)用去甲基化藥物會對正常細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒副作用。因此，尋找針對不同的抑癌基因的靶向的甲基化藥物成為研究的重點(diǎn)以及難點(diǎn)。
作者：柳鳳芝 王季石 朱紅倩 單位：貴州省人民醫(yī)院血液科 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科
