急性早幼粒細(xì)胞白血病實(shí)驗(yàn)室診斷范文

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摘要：

目前，急性早幼粒細(xì)胞白血病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要是以細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查為基礎(chǔ)，結(jié)合免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)檢驗(yàn)的MICM綜合性診斷技術(shù)。近幾年，D-二聚體在急性早幼粒細(xì)胞白血病中的診斷價(jià)值也逐漸被臨床重視。本文將對這些實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：

急性早幼粒細(xì)胞白血病；MICM分型；D-二聚體；FISH；FCM

急性早幼粒細(xì)胞白血病（acutepromyelocyticleukemia，APL）是急性髓細(xì)胞白血病（acutemyeloblasticleukemia，AML）的M3亞型[1]，多伴有異常染色體t（15；17）而形成PML-RARα融合基因。以異常早幼粒細(xì)胞增生為主，臨床上除有發(fā)熱、感染、貧血和浸潤等急性白血病的癥狀外，廣泛而嚴(yán)重的出血常是本病的特點(diǎn)，易并發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），可發(fā)生原發(fā)性纖溶亢進(jìn)。經(jīng)誘導(dǎo)化療或骨髓移植后達(dá)到臨床完全緩解（CR），但體內(nèi)依然會(huì)殘存約106~108個(gè)微量白血病細(xì)胞（MRLC），即微量殘留白血病（minimalresiduaidisease，MRD）[2]，而這些細(xì)胞則是APL復(fù)發(fā)的根源。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，通過聯(lián)合測定PML-RARα融合基因進(jìn)行診斷，即將形態(tài)學(xué)（morphology，M）、免疫學(xué)（immunology，I）、細(xì)胞遺傳學(xué)（cytogenetics，C）和分子生物學(xué)（molecu-lar，M）相聯(lián)合的MICM分型技術(shù)[3]，極大地提高了APL診斷的準(zhǔn)確率，并為MRD提供了更為可靠的診斷依據(jù)。本文結(jié)合近幾年相關(guān)學(xué)者利用MICM分型技術(shù)和D-二聚體檢測等在APL上的診斷報(bào)道及相應(yīng)研究成果，對這些診斷方法進(jìn)行綜述，并探討各診斷方法的優(yōu)劣。

1血細(xì)胞形態(tài)學(xué)在診斷中的應(yīng)用

1.1血象APL的血涂片觀察，可見血紅蛋白和紅細(xì)胞呈不同程度的減少；血小板中度到重度減少，多數(shù)為（10~30）×109/L。白細(xì)胞計(jì)數(shù)大多病例在15×109/L以下，明顯減少者見于全血細(xì)胞減少，但也可有明顯增高（M3v型），分類以異常早幼粒細(xì)胞為主，也可見少數(shù)原粒及其他階段粒細(xì)胞，胞漿易見Auer小體。

1.2骨髓象多數(shù)APL病例骨髓增生極度活躍，個(gè)別病例增生低下。各階段幼紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞形態(tài)分類以早幼粒細(xì)胞為主，占30%~90%（NEC），可見少量的原粒和中幼粒細(xì)胞。增多的早幼粒細(xì)胞形態(tài)異常，大小不一，外形呈橢圓形或不規(guī)則形。胞核扭曲變形，可見雙核，核染色質(zhì)疏松有明顯核仁。胞質(zhì)中含多量大小不等的嗜苯胺藍(lán)顆粒[4]，根據(jù)胞質(zhì)中顆粒的不同可分為3個(gè)亞型：粗顆粒型（M3a），顆粒粗大深染密集；細(xì)顆粒型（M3b），顆粒密集而細(xì)小；變異型（M3v），顆粒極少甚至沒有。

1.3細(xì)胞化學(xué)染色過氧化物酶（POX）、蘇丹黑染色（SBB）、酸性磷酸酶（ACP）、非特異性脂酶（NSE）均呈陽性或強(qiáng)陽性；且非特異性脂酶（NSE）不被NaF抑制，中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶（NAP）積分減低。通過APL細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征而對其進(jìn)行分型主要依據(jù)1976年法（F）、美（A）、英（B）三國協(xié)作組提出的急性白血病FAB形態(tài)學(xué)分型方案及診斷標(biāo)準(zhǔn)（1985年有修改）[5]。借助光學(xué)顯微鏡和一定的細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)，在形態(tài)學(xué)上對APL做出初步的分型診斷。由于僅是憑借人眼進(jìn)行分型，其在細(xì)胞形態(tài)的辨認(rèn)上易受檢驗(yàn)人員學(xué)識水平、工作經(jīng)驗(yàn)等因素影響，從而影響對APL分型的準(zhǔn)確性；且靈敏度低，對于MRD的監(jiān)測也很難實(shí)施。近幾十年，國際上在白血病FAB分型的基礎(chǔ)上又開展了免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的研究工作，大大提高了對白血病診斷的準(zhǔn)確性也更利于對MRD的監(jiān)測[6]。但利用光學(xué)顯微鏡的形態(tài)學(xué)診斷也一直被臨床沿用，主要由于光學(xué)顯微鏡方便易得，成本相對較低，利于普及，特別是基層醫(yī)院，可以作為白血病篩查的主要手段；且對于細(xì)胞形態(tài)典型的病例，血細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷更是有利于疾病的及時(shí)診斷和治療。

2免疫學(xué)分型在診斷中的應(yīng)用

典型的APL免疫學(xué)表型呈CD13、CD33陽性，CD34及HLA-DR陰性，CD34陽性的APL惡性細(xì)胞顆粒小而少，且易出現(xiàn)白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高，預(yù)后較差[7]。近年來隨著單克隆抗體的不斷開發(fā)及流式細(xì)胞術(shù)的廣泛開展，急性白血病免疫表型研究得到迅猛發(fā)展，極大地提高了APL診斷和分型的準(zhǔn)確性[8]。同時(shí)隨著流式細(xì)胞儀（FCM）性能的不斷完善，也使得MRD的檢測更為靈敏。FCM是將單克隆抗體、流體力學(xué)、免疫熒光、計(jì)算機(jī)等技術(shù)相結(jié)合，測量射門參數(shù)在單細(xì)胞水平上辨認(rèn)細(xì)胞形態(tài)、大小和熒光等特征，其檢測快速、簡便，特異性好、敏感度高，能對大量細(xì)胞進(jìn)行定量分析，使用的單克隆抗體容易購買，價(jià)格相對便宜，便于臨床推廣。但由于目前缺乏理想的抗體組合，F(xiàn)CM檢測APL患者M(jìn)RD的靈敏度還較低[9]；且隨著病程發(fā)展，細(xì)胞表面的抗原發(fā)生改變，亦會(huì)導(dǎo)致結(jié)果假陰性。因此，較多研究中心建議同時(shí)采用多種不同的免疫表型會(huì)使這種影響降至最低[10]。張紅靈等[11]人采用一組四色熒光標(biāo)記單克隆抗體組合（CD15-CD11b-CD33-CD45）的流式細(xì)胞儀對40例初診時(shí)經(jīng)形態(tài)學(xué)及流式免疫分型診斷為APL的白血病患者及其治療后12例骨髓標(biāo)本進(jìn)行檢測，同時(shí)檢測正常對照8例。以CD45/SSC選定粒細(xì)胞門，選出其中CD33+細(xì)胞再進(jìn)一步分析CD11b及CD15的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD33+APL白血病細(xì)胞群均表達(dá)CD15-CD11b-CD33+，有少數(shù)病例同時(shí)含有少量CD15-CD11b+CD33+分化細(xì)胞。而在正常骨髓標(biāo)本中以CD45/SSC設(shè)門粒細(xì)胞群CD15-CD11b-CD33+細(xì)胞多數(shù)為0，以CD15++CD11b++細(xì)胞為主，少數(shù)表達(dá)CD15+CD11b++，CD15+CD11b+，CD15++CD11b+和CD15++CD11b-細(xì)胞，表現(xiàn)出與白血病早幼粒細(xì)胞明顯不同的表型。因此四色組合FCM可用于APL中MRD的檢測。

3細(xì)胞遺傳學(xué)在診斷中的應(yīng)用

約70%~90%的APL具有特異染色體t（15；17）易位，形成PML-RARα融合基因，這是APL特有的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志[12]。PML-RARα產(chǎn)物可抑制RARα-RXR二聚體，進(jìn)而使早幼粒細(xì)胞分化成熟障礙[13]。臨床上全反式維甲酸ATRT誘導(dǎo)分化治療能使85%左右的APL患者獲得緩解，預(yù)后較好；極少數(shù)無此融合基因者，維甲酸治療不敏感，預(yù)后較差。常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)中的染色體檢驗(yàn)主要包括染色體顯帶/非顯帶技術(shù)、染色體高分辨技術(shù)和染色體脆性部位顯示技術(shù)等。侯繼申等人[14]研究表明APL的細(xì)胞遺傳學(xué)與形態(tài)學(xué)的相關(guān)性并不總是一致的。少數(shù)具變異易位核型、變異型APL患者常表現(xiàn)不典型的形態(tài)學(xué)特征，易誤診為其他白血病。其研究的39例APL患者中有2例APL初診時(shí)被誤診為M2和M5，其中1例早幼粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)富含多個(gè)空泡、顆粒稀少，可能與早幼粒細(xì)胞顆粒缺失導(dǎo)致空泡形成有關(guān)，經(jīng)核型分析確診。因此常規(guī)染色體核型分析在形態(tài)不典型的APL診斷中具有重要作用，可提高APL診斷的準(zhǔn)確性和靈敏度。常規(guī)染色體核型分析作為經(jīng)典的分析細(xì)胞遺傳學(xué)方法，已研究的較為成熟，由于著眼于所有染色體因此容易發(fā)現(xiàn)新的染色體異常，其主要不足是對于標(biāo)本質(zhì)量要求較高，靈敏度較低，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，且對于導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的微小殘留病監(jiān)測較不敏感[15]。

4分子生物學(xué)檢驗(yàn)在診斷中的應(yīng)用

4.1熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是一種高分辨率和高靈敏度的染色體和基因分析技術(shù)[16]，通過將生物素標(biāo)記的DNA探針與互補(bǔ)的DNA鏈染色體原位雜交，熒光顯色后顯微鏡觀察，其將細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)充分結(jié)合，不僅用于分裂中期細(xì)胞，還可用于細(xì)胞分裂間期，拓展了檢測范圍，提高了白血病診斷和MRD檢測的靈敏度[17]。鄭玲等人[18]利用多重?zé)晒庠浑s交（M-FISH）技術(shù)對20例APL患者進(jìn)行檢測，并與常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）結(jié)果相比較，從而揭示了M-FISH對于APL的診斷及其MRD的檢測有重要應(yīng)用價(jià)值：M-FISH雖不如RT-PCR敏感，但其反映的是處于增殖期的單個(gè)白血病細(xì)胞的狀況，通過反復(fù)檢測可以動(dòng)態(tài)地觀察體內(nèi)白血病細(xì)胞負(fù)荷的消長，似比RT-PCR更能預(yù)測白血病的復(fù)發(fā)。同時(shí)GordonDewaldW[19]在其報(bào)道中表明FISH還可以檢測一些變異型的RARα融合基因，且檢測效率高，利于標(biāo)準(zhǔn)化開展。

4.2聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種用于體外擴(kuò)增核酸片段的技術(shù)[20]，在進(jìn)行APL檢測時(shí)目前臨床常用的是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）以及在PCR反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RQ-PCR）[21]。趙威等人[22]利用實(shí)時(shí)定量PT-PCR技術(shù)可檢測出10-5μg人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株（NB4）細(xì)胞cDNA中的PML-RARα融合基因，其靈敏度高、重復(fù)性好，且有助于監(jiān)測白血病微小殘留病灶。實(shí)時(shí)定量RT-PCR是在普通PCR反應(yīng)中加入能與PCR產(chǎn)物結(jié)合的熒光探針或熒光染料，使之熒光信號隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而成比例增長，儀器實(shí)時(shí)檢測每一個(gè)循環(huán)結(jié)束后的熒光強(qiáng)度，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比得出定量結(jié)果[23]，動(dòng)態(tài)監(jiān)測PML-RARα融合基因，以及PML-RARα亞型[24]，來檢測APL細(xì)胞的殘余數(shù)量和預(yù)測復(fù)發(fā)，還可以預(yù)測白血病患者的治療反應(yīng)，從而成為指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療、預(yù)防復(fù)發(fā)和提高患者生存率的重要手段。

5D-二聚體檢測在APL中的臨床價(jià)值

近年來，D-二聚體在幫助診斷凝血系統(tǒng)和纖溶亢進(jìn)，特別是繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)等方面的臨床價(jià)值越來越受到醫(yī)學(xué)專家的重視[25]。急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）在疾病進(jìn)程和治療期最常見的臨床表現(xiàn)是廣泛而嚴(yán)重的出血[26]，甚至出現(xiàn)顱內(nèi)出血，且易并發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），從而繼發(fā)纖溶亢進(jìn)。究其原因，有研究表明因?yàn)锳PL的異常早幼粒細(xì)胞具有合成釋放大量促凝物質(zhì)的能力，如組織因子，這些促凝物質(zhì)會(huì)激活凝血系統(tǒng)，引起繼發(fā)性的纖溶功能亢進(jìn)，當(dāng)這些細(xì)胞增多到一定程度時(shí)，血液將呈現(xiàn)為高凝狀態(tài)，機(jī)體內(nèi)微循環(huán)廣泛形成血栓，進(jìn)一步促進(jìn)繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)，造成嚴(yán)重出血等并發(fā)癥狀。因而血漿D-二聚體的檢測對APL有一定的診斷意義。董大鵬等人[27]通過臨床上72例APL患者治療前和治療后D-二聚體含量檢測結(jié)果分析得出該指標(biāo)有較高的靈敏度，能夠較好的反應(yīng)早期患者體內(nèi)的纖溶亢進(jìn)及凝血系統(tǒng)激活狀態(tài)。通過檢測患者血D-二聚體含量可以直接反映D-二聚體水平和患者病情的變化情況，因此能夠作為APL病情進(jìn)展及預(yù)后的重要參考指標(biāo)[28]，且該指標(biāo)的檢測在臨床上簡便、快速、成本低，利于普及。但值得注意的是，任何引起DIC的疾病都會(huì)導(dǎo)致D-二聚體的增高，因此缺乏特異性，一般只作為APL繼發(fā)DIC診斷的實(shí)用性指標(biāo)[29]。

綜上所述，APL的實(shí)驗(yàn)室診斷方法已不單靠FAB形態(tài)學(xué)分型，免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)的發(fā)展，為白血病的診斷，特別是MRD的診斷，提供了更精確，更敏感，更為標(biāo)準(zhǔn)化的檢測技術(shù)。這不僅使我們對APL的本質(zhì)、發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)特性有了進(jìn)一步的了解，而且對指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后復(fù)發(fā)更是具有相當(dāng)大的臨床實(shí)用價(jià)值。而FCM、FISH、PCR等這些技術(shù)的應(yīng)用雖然大大提高APL診斷敏感性，但由于其對儀器和試劑的要求條件高、成本高，且檢測周期較長，目前在臨床較難完全普及。而針對APL，由于其更易并發(fā)DIC，D-二聚體的檢測雖然特異性不強(qiáng)，但在于其成本較低，敏感性較高，也逐漸被臨床所重視。因此在節(jié)約成本、減少診斷時(shí)間、為患者爭取寶貴的治療時(shí)間上，APL的實(shí)驗(yàn)室診斷方法依然還有更廣闊的研究空間[30]。

作者：薛白 李靖 王奔放 單位：江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院 江陰人民醫(yī)院檢驗(yàn)科