前列腺癌細胞系中轉移相關基因范文

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【摘要】

目的：通過基因芯片技術檢測具有不同轉移潛能的前列腺癌細胞系LNCaP和C4－2中表達差異的基因，尋找前列腺癌轉移相關基因。方法：采用TRIzol一步法提取LNCaP和C4－2細胞的總RNA，并純化mRNA，反轉錄合成熒光分子標記的cDNA探針，與基因芯片雜交。采用GenepixPro6．0圖像分析軟件進行芯片圖像分析，把圖像信號轉化為數字信號，然后以差異大于等于2倍的標準來確定差異表達基因。結果：在LNCaP與C4－2細胞中，表達差異的基因共有417個，上調基因301個，下調基因116個。分析顯示差異表達基因分別與細胞增殖、代謝、細胞因子、細胞轉移等相關，其中發現7個基因與腫瘤細胞的轉移相關，分別為EGFR、EGF、PIK3R1、CyclinE、HYAL1、GNAI1、AZGP1。結論：篩選出LNCaP與C4－2細胞系中7個轉移相關基因，為進一步研究前列腺癌轉移機制奠定了基礎。

【關鍵詞】

基因芯片；LNCaP細胞；C4－2細胞；轉移；前列腺癌

前列腺癌是男性常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤之一，在歐美國家，男性所有腫瘤中PC占了30％，病死率僅次于肺癌居第二［1］。隨著我國人民生活水平的提高、生活方式的改變及男性平均壽命的延長，前列腺癌的發病率不斷上升。有學者［2］在1941年發現前列腺癌是一種雄激素依賴的惡性腫瘤，雄激素通過與前列腺癌細胞的雄激素受體（androgenreceptor，AR）結合激活下游的分子信號通路，促進前列腺癌增殖?？剐奂に刂委熆裳泳徢傲邢侔┑倪M展，改善患者生活質量［3］。因此，手術及藥物去勢等雄激素剝奪相關的內分泌治療對前列腺癌患者有顯著療效。然而，約90％的前列腺癌患者在接受雄激素剝奪治療12～24個月后會對內分泌治療發生抵抗，進展為雄激素非依賴的去勢抵抗型前列腺癌，腫瘤進展加快，發生遠處轉移，因缺乏有效的治療措施最終導致患者死亡［4－5］。目前有效控制腫瘤的進展，防止腫瘤發生遠處轉移是前列腺癌研究領域的熱點，因此，明確前列腺癌轉移的分子機制，尋找有效的治療靶點，對前列腺癌的治療尤為迫切。本研究通過基因芯片技術，尋找具有低轉移潛能的前列腺癌細胞LNCaP及其衍生的雄激素非依賴的轉移細胞系C4－2間表達差異的基因，并分析與轉移相關的差異基因，為探索前列腺癌轉移相關分子機制提供一定的線索和研究基礎。

1材料與方法

1．1材料前列腺癌細胞系LNCaP、C4－2購自上海細胞庫；人類全基因組芯片購自Agilent公司；胎牛血清購自Hyclone公司；TRIzol購于Invitrogen公司，RNA反轉錄試劑購自TaKaRa公司；總RNA的純化試劑盒及cRNA純化試劑盒購自QIAGEN公司；基因表達雜交試劑盒（貨號5188－4242），RNASpikeInKit試劑盒（貨號：5188－5282）購自Agilent公司。

1．2細胞培養與總RNA提取及純化LNCaP、C4－2前列腺癌細胞用含100ml／L胎牛血清的1640培養基，置于37℃、50ml／LCO2培養箱中培養。細胞匯合度達到80％～90％融合后，PBS液體洗兩遍，加入TRIzol反復吹打，充分裂解細胞，加入氯仿室溫靜置15min，4℃，12000r／min離心10min，吸取上清，加入異丙醇靜置10min后，4℃，12000r／min離心10min，75％酒精洗滌沉淀，離心，室溫靜置5min，加入DEPC處理水溶解RNA，－70℃保存。抽提總RNA的濃度和質量采用分光光度計及瓊脂糖膠電泳測定。總RNA純化的詳細步驟嚴格按照QIAGENRNeasyMiniKit操作。

1．3熒光標記cRNA合成及純化嚴格遵循Agilent芯片表達分析實驗方法進行雙鏈cDNA的合成、熒光標記cRNA的合成以及cRNA的片段化等過程。cDNA第一鏈和第二鏈以randomPromoterprimer為引物配制cDNA合成體系運用一步法合成；cRNA以熒光染料標記后，以QIAGENRNAeasyminikit純化cRNA，以分光光度計分析cRNA濃度（具體操作步驟詳見AgilentcDNA表達譜芯片操作指南）。

1．4芯片雜交cRNA片段化后加入HybridizationBuffer混勻配制雜交液后滴加于芯片上雜交過夜。芯片雜交后的洗滌、染色過程遵照標準的Agilent表達譜芯片實驗指南進行。

1．5數據分析芯片結果采用AligentScanner來獲取圖像，通過Imagene轉化為數值后應用Genespring分析軟件將數值進行標準化，取得Ratio值。一般認為Ratio值在0．5～2．0范圍內的基因不存在顯著的表達差異，而在該范圍之外的基因被認為表達出現顯著改變。因此，實驗結果將兩個細胞株之間差異表達平均倍數≥2．0倍或≤0．5者篩選出來，作為上調和下調的候選研究基因。對差異表達基因的分析借助于GenBank數據庫、GO分析等完成。

2結果

2．1mRNA基因表達圖譜分析C4－2與LNCaP細胞比較，基因表達上調2倍的mRNA基因有301個，基因下調2倍的mRNA基因有116個。芯片雜交散點圖如圖1所示，圖中每一個數據點代表芯片上一個基因點的雜交信號，越偏離兩條線的點，表示此基因在C4－2與LNCaP的差異越明顯。在兩條線之內或者重合的點，表示此基因在兩株細胞系中無明顯差異。

2．2轉移相關差異表達基因分析結果結合基因芯片的結果，通過GO富集分析發現EGFR、EGF、PIK3R1、CyclinE、HYAL1、GNAI1、AZGP1可能與前列腺癌轉移相關，結果見表1。

3討論

早期前列腺癌患者的10年生存率較高，但一旦發生轉移預后不佳［6］。遠處轉移以骨骼和淋巴結為常見，70％～80％患者最終出現骨轉移。因此明確前列腺癌轉移的分子機制具有重要意義。實驗中我們選用前列腺癌細胞LNCaP與其轉移性亞型C4－2細胞作為研究對象，二者有相同的基因背景，LNCaP是原發性前列腺癌細胞株，轉移性弱，C4－2轉移能力強。本研究通過基因芯片技術快速、準確地分析數以千計的基因組信息，檢測表達差異的分子，尋找前列腺癌轉移相關的關鍵分子，為前列腺癌轉移的分子機制研究提供一定的理論基礎。表皮生長因子（EGF）是一種細胞調節多肽。研究表明EGF具有促進細胞分裂增殖的作用。它通過靶細胞膜上的EGFR使受體酪氨酸殘基磷酸化而引發細胞的增殖效應。研究顯示EGFR過表達于多種腫瘤，其介導的信號傳導影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、浸潤轉移及血管生成［7－8］，與腫瘤惡性程度、轉移、放化療敏感度下降密切相關，許多阻滯和下調EGFR的方法被用來抑制腫瘤增殖以改善預后［9］。已有研究證實EGFR過表達與前列腺癌從激素依賴性進展至激素非依賴性相關［10］。本研究中發現C4－2細胞中EGF、EGFR表達異常增高，提示EGFR信號通路在前列腺癌轉移過程中可能發揮了重要的作用。PIK3R1又稱p85α，有研究已證實p85α是AR異常激活和前列腺癌激素抵抗性進展所必須的［11］。CyclinE是重要的細胞周期正性調節因子，CyclinE過表達使細胞G1期進程縮短，提前進入S期，加快轉換的步伐和增加輪回數，造成細胞的無限增殖－腫瘤的形成。CyclinE與腫瘤血管的生成和腫瘤的轉移關系密切［12］。因此CyclinE異常表達與前列腺癌等腫瘤的發生發展密切相關，并且可能在前列腺癌的進展中發揮著重要作用。最新的研究顯示G蛋白偶聯受體家族成員GNAI1可以抑制腫瘤的遷移和侵襲［13］，本研究發現C4－2細胞中GNAI1低表達，提示GNAI1在前列腺癌進展過程中，其抑制腫瘤侵襲轉移的功能下降，導致腫瘤發生轉移。有研究顯示AZGP1的表達降低與胃癌的預后不良密切相關，他們的研究表明AZGP1可以作為一個候選的抑癌基因［14］。HYAL1編碼透明質酸酶在乳腺癌細胞及組織中高表達，促進腫瘤的生長、增殖、侵襲轉移能力［15］。此外，透明質酸酶在胰腺癌中異常高表達預示著患者預后不良［16］。

本課題通過應用基因芯片技術，比較具有相同遺傳背景而轉移特性不同的兩株前列腺癌細胞系中基因的表達，發現7個前列腺癌轉移相關基因，并對各個基因在腫瘤轉移中的研究進行了探討，為前列腺癌轉移的分子機制提供了重要的理論基礎。

作者：吳磊 惠慧 雒小佳 樊利妮 王浩 王凱 單位：陜西省腫瘤醫院 西安交通大學醫學院第一附屬醫院