子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞論文范文

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1材料和方法

1．1材料來源

1．1．1Westernblot法檢測用蛋白裂解緩沖液提取蛋白，取上清用ELISA試劑盒(德國，Pierce)檢測總蛋白濃度。取70μg的總蛋白于10%SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂奶封閉，分別加兔抗人Matriptase(1∶1000)、兔抗人HAI-1(1∶10000)，使用鼠源性β-actin單克隆抗體(1∶1000)作為內(nèi)參照，4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色，于暗室中顯影定影。X片用Tan-non圖像分析系統(tǒng)照相，采用TanonGis軟件4．0自動分析軟件進(jìn)行積分光密度分析，以Matripase(HAI-1)/β-actin積分光密度比值表示相對蛋白含量。

1．1．2RNA干擾構(gòu)建3條由慢病毒載體表達(dá)的Matriptase基因siRNA(Ma-siRNA-89851、-siRNA-89881和-siRNA-89873)，其中Ma-siRNA-89873對Matriptase抑制水平最顯著。實(shí)驗(yàn)前1天，HEC-1A和RL952細(xì)胞接種在6孔板，密度約(3～5)×104/ml，配制1×108TU/ml病毒。根據(jù)預(yù)染結(jié)果，每孔加病毒量20μl，總體積1ml，轉(zhuǎn)染72h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)情況，同時(shí)以正常培養(yǎng)基為空白對照組(Control，Con)慢病毒載體NO53為陰性對照組(Negativecontrol，NC)。熒光定量PCR和Westernblot法檢測siRNA干擾后Matriptase表達(dá)情況。

1．1．3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用ImageJ軟件測量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的劃痕兩側(cè)的細(xì)胞間距離(μm)變化，以0h劃痕邊沿的距離減去24h遷移邊沿的距離來計(jì)算細(xì)胞的遷移距離，反映細(xì)胞的遷移能［4］。

1．1.4穿膜小室實(shí)驗(yàn)Transwell小室直徑上取5個(gè)視野，照相，計(jì)數(shù)每個(gè)視野穿過膜的細(xì)胞數(shù)，取其平均值，結(jié)果以x珋±s表示。以穿膜細(xì)胞數(shù)反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［5］。

1．2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)軟件。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x珋±s表示，計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析，雙變量相關(guān)分析采用Person分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1熒光定量PCR和Westernblot檢測Matriptase、HAI－1mRNA及蛋白表達(dá)情況HEC-1A、HEC-1B、RL952細(xì)胞中，MatriptasemRNA相對表達(dá)量分別為(0．2123±0．021)、(0．000695±0．00012)和(0．1778±0．013)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122．629，P＜0．001);HAI-1mRNA相對表達(dá)量分別為(0．2827±0．049)、(0．00263±0．00043)和(0．2420±0．032)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32．875，P＜0．01)。Matriptase和HAI-1蛋白在HEC-1A和RL952中均呈陽性表達(dá)，但兩者在HEC-1B中均未表達(dá)或低于可測水準(zhǔn)，與mRNA水平相吻合。HEC-1A、RL952和HEC-1B細(xì)胞中Matriptase/HAI-1mRNA比值分別為0．75、0．73和0．02;HEC-1A和RL952細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)(圖1)。

2．2轉(zhuǎn)染siRNA后HEC-1A和RL952細(xì)胞中Matriptase、HAI-1mRNA和蛋白表達(dá)HEC-1A和RL952細(xì)胞中，空白組(Con)和陰性對照(NC)組中Matriptase和HAI-1的表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。與陰性對照組(NC)比較，轉(zhuǎn)染siRNA-89873后兩株細(xì)胞的MatriptasemRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)(HEC-1A:0．2157±0．0124vs0．0358±0．0111，P＜0．001;RL952:0．1849±0．0053vs0．0341±0．0017，P＜0．001)，抑制率分別達(dá)到83．4%和81．5%;但兩株細(xì)胞的HAI-1mRNA表達(dá)水平無顯著差異(P＞0．05)。Matriptase和HAI-1蛋白水平改變情況與mRNA水平相一致(圖2、3)。轉(zhuǎn)染Matriptase的靶向siRNA后，子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞的Matriptase/HAI-1的比值降為0．11，而RL-952細(xì)胞則降為0．12。

2．3RNA干擾后HEC-1A和RL952侵襲遷移能力的改變小分子RNA干擾Matriptase表達(dá)后兩株細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力變?nèi)酢erson相關(guān)性分析顯示，MatriptasemRNA表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞遷移距離和穿膜細(xì)胞數(shù)均呈正相關(guān)(R遷移=0．97，R侵襲=0．982;P均＜0．01)。

3討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，包括降解ECM從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分離、種植和遠(yuǎn)處擴(kuò)散。目前認(rèn)為，基質(zhì)金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶在該過程中扮演了重要的角色。Matriptase是TTSPs家族成員之一，與腫瘤的增殖、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球女性腫瘤發(fā)病率中，子宮內(nèi)膜癌占第四位，僅次于乳腺癌、肺癌和大腸癌，居全球女性生殖道腫瘤的第一位。迄今為止，子宮內(nèi)膜癌中Matriptase/HAI-1相關(guān)性的研究僅有2篇，Matriptase/HAI-1在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色尚未可知。Nakamura等首次提出，Matriptase可能與子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后不良相關(guān)，Matriptase高表達(dá)與侵及子宮肌層深度(P=0．004)、宮頸浸潤(P=0．021)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0．009)及腹水細(xì)胞學(xué)(P=0．045)等侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為密切相關(guān)。HAI-1作為ECM降解系統(tǒng)的另一重要角色，在子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本中表達(dá)水平明顯低于正常內(nèi)膜標(biāo)本;增加HAI-1基因的表達(dá)水平可有效抑制內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲遷移能力，且伴隨著Matriptase表達(dá)水平的下調(diào)。由此有學(xué)者提出，維持Matriptase/HAI-1的平衡狀態(tài)在腫瘤的進(jìn)展過程中至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，Matriptase/HAI-1比值的失衡包括上升或下降都可能具有促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在胰腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HAI-1表達(dá)水平下降，伴隨Matriptase表達(dá)水平升高，HAI-1表達(dá)的缺失和Matfiptase/HAI-1比值降低促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲生物學(xué)特征。同樣在前列腺癌中亦發(fā)現(xiàn)，Matfiptase/HAI-1比值隨著前列腺癌惡性程度的遞增而升高。而Matriptase/HAI-1比值在進(jìn)展期結(jié)直腸癌中表現(xiàn)為下降，在浸潤性乳腺癌中比值下降而在侵襲性乳腺癌中比值明顯上升。本研究在Matriptase和HAI-1陽性表達(dá)的子宮內(nèi)膜腺癌RL952細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞中Matriptase和HAI-1表達(dá)水平及Matriptase/HAI-1比值，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，侵襲遷移能力亦無差異;而HEC-1B細(xì)胞呈Matriptase和HAI-1極低水平，mRNA和蛋白均顯示為陰性表達(dá)。在Matriptase-HAI-1系統(tǒng)陽性的HEC-1A和RL952細(xì)胞中，采用siRNA特異性下調(diào)Matriptase表達(dá)，HAI-1基因表達(dá)未見變化，但Matriptase/HAI-1比值由敲除前約0．77降低到敲除后0．11，而細(xì)胞的侵襲遷移能力顯著下降。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，Matriptase表達(dá)水平、Matriptase/HAI-1比值與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲遷移能力呈正相關(guān)。HEC-1B細(xì)胞為高侵襲能力細(xì)胞株，而其Matriptase和HAI-1系統(tǒng)呈陰性表達(dá)，猜想與細(xì)胞的遺傳背景不同相關(guān)(如雌激素受體表達(dá)水平)，且腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程復(fù)雜，所涉及信號通路繁多，如抗凝血酶、蛋白酶活化受體2(protein-aseactivatedreceptor-2，PAR-2)、前列腺蛋白酶原、miRNA等。此外亦有文獻(xiàn)報(bào)道，Matriptase表達(dá)水平和Matriptase/HAI-1比值在進(jìn)展至侵襲階段時(shí)呈降低趨勢，后期可通過增加Matriptase表達(dá)水平進(jìn)一步探究Matriptase在子宮內(nèi)膜癌侵襲遷移過程中扮演的角色。

綜上，Matriptase表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲遷移能力呈正相關(guān)。但為了但全面完善評估Matriptase在子宮內(nèi)膜癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的角色，動物體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)必不可少。總之，Matriptase與子宮內(nèi)膜癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，可能成為判斷腫瘤預(yù)后的新指標(biāo)及輔助治療的新靶標(biāo)。

作者：薛麗芳孫蓬明項(xiàng)雙衛(wèi)毛曉丹阮冠宇董濱華林芬單位：福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院福建省婦幼保健院婦科腫瘤實(shí)驗(yàn)室福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科