小鼠黑質多巴胺能神經元的研究范文

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【摘要】目的:探討趨化因子CCL2(ChemokineC-CmotifLigand2)對小鼠黑質多巴胺能神經元的損傷。方法:將CCL2單次注射入C57BL/6J小鼠黑質部位，在注射前和注射后的各個時間點分別記錄小鼠的行為軌跡，并將注射后不同時間點的小鼠灌注固定取腦，通過免疫組織化學方法檢測黑質多巴胺能神經元的數量變化。結果:免疫組化檢測顯示在CCL2注射后21d開始黑質多巴胺能神經元的數量明顯減少，并顯著低于對照組，一直持續到注射后28d;并且在注射后28d時小鼠的運動速度顯著低于對照組。結論:腦內注射CCL2可以損傷小鼠黑質多巴胺能神經元。

【關鍵詞】趨化因子CCL2;黑質;多巴胺能神經元;小鼠

帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是常見、多發的與年齡相關的一種神經變性疾病，PD的主要病理表現為黑質(substantianigra，SN)多巴胺(dopa-mine，DA)能神經元的變性減少［1］。盡管認識到DA能神經元缺失這一主要神經改變是PD發病的根本已有數十年之久，但對其確切病因尚沒有滿意答案。近年來人們發現，腦內炎癥在PD的發病過程中具有重要作用:尸檢分析發現PD病人黑質紋狀體系統中有小膠質細胞的增加和激活，小膠質細胞分泌的促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和TGFβ2等明顯增高［2，3］。CCL2(Chemokine(C-CMotif)Lig-and2)又稱MonocyteChemoattractantProtein1(MCP-1)，是CC族趨化因子成員之一，是由炎癥信號誘導分泌的一種典型的趨化因子［4］。在中樞神經系統，星形膠質細胞和小膠質細胞都是CCL2的主要來源，在小膠質細胞上有CCL2的特異性受體CCR2［5］。有研究發現，CCL2可以招募并激活小膠質細胞，表現出吞噬功能并釋放大量的自由基、細胞毒性細胞因子等［6］，有文獻報道，PD患者外周單核細胞CCL2表達增加，PD病人腦脊液中CCL2的濃度和PD一些癥狀的嚴重程度呈正相關［7］。那么CCL2在PD的發病過程中究竟有什么作用呢，目前為止還未見報道。本文將探討黑質內注射CCL2是否能夠損傷黑質多巴胺能神經元并引起相應的行為學改變，以期揭示黑質多巴胺能神經元損傷的部分機制。

材料和方法

1材料

1．1動物

本研究所用動物為8周雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，由首都醫科大學實驗動物部提供。飼養條件為SPF級，動物處于每天12h光照與12h黑暗交替環境，自由飲水攝食。

1．2主要試劑

小鼠重組CCL2(Sigma美國)溶于高壓滅菌的0．01mol/LPBS中，終濃度為50ng/μl，所用抗體為小鼠抗TH抗體(Sigma美國)。

2方法

2．1小鼠黑質立體定位注射

小鼠稱重，用6%水合氯醛按6ml/kg體重腹腔注射麻醉。將麻醉好的小鼠固定于腦立體定位儀(DavidKopF美國)上，頭部備皮，并用常規碘酒和酒精消毒，取正中矢狀切口，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離，直至暴露顱骨。根據GeorgePaxinos第二版小鼠腦立體定位圖譜確定黑質注射位點坐標。選擇的注射位點坐標為:前囟后(－)3．00mm，正中線旁開(L)1．1mm，硬腦膜下(V)4．5mm。用牙科鉆于相應顱骨處鉆開一小孔，用針頭挑破并去除小孔處的腦膜。用Hamilton微量注射器分別將500ngCCL2(實驗組)或者相同體積的無菌0．01mol/LPBS(對照組)于上述注射位點按1μl/min的速度緩慢勻速地注射到小鼠黑質部位，注射完畢后留針10min，以防止液體溢出，然后緩緩退出Hamilton微量注射器。縫合皮膚切口，并用碘酒和酒精消毒，將動物放置于溫暖的環境中，待其蘇醒后給予食水。取注射后7d、14d、21d和28d4個時間點進行檢測，每個時間點取8只動物，總計64只動物。

2．2小鼠行為學分析

分別于給藥前(0d)和給藥后(7d、14d、21d和28d)記錄小鼠行為軌跡。將小鼠放置于相同的無蓋盒內(長30cm，寬20cm)，5min后用SONY數碼攝影機從盒子上方記錄小鼠行為運動15min，記錄均在上午10點進行。采用實驗動物行為軌跡分析軟件(EthoVision，Version8．0)計算小鼠每5min在盒內的平均運動速度(cm/s)和運動距離(cm)，圖像采集6幀/秒。

2．3灌注取材

不同時間點的小鼠在做過行為學測試后進行灌注固定，用6%水合氯醛腹腔注射麻醉，按6ml/kg劑量給藥，待小鼠進入深度麻醉，將小鼠腹面朝上妥善固定于蠟盤上，充分暴露心臟。先灌注0．9%生理鹽水，將血液沖干凈后再灌注含4%的多聚甲醛的磷酸緩沖液(PB)。灌注完畢后，用咬骨鉗剝離顱骨及硬腦膜取出腦，放入上述相同的固定溶液中繼續后固定4h，然后將腦組織放入含30%蔗糖的PB溶液中脫水，腦組織均4℃保存，待其完全沉底后即可進行冰凍冠狀切片，切片厚為40μm，每6張取一張。

2．4免疫組織化學染色

切片入3%H2O2中10min以清除內源性過氧化物酶的活性，切片入0．01mol/LPBS清洗3次，10min/次，切片入封閉液(含5%羊血清和0．01%TritonX-100)封閉1h，以上過程均在室溫下進行。切片在一抗(小鼠抗TH抗體，1∶5000)中4℃過夜，再入生物素標記的二抗(羊抗小鼠IgG，1∶300)室溫孵育2h，切片入HRP標記的鏈酶卵白素(1∶300)室溫孵育2h;以上每個步驟結束后切片均入0．01mol/LPBS室溫漂洗3次，10min/次。DAB顯色液孵育顯色，控制顯色程度，轉入0．01mol/LPBS終止反應。切片入0．01mol/LPBS中裱片，自然干燥，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片;顯微鏡下觀察并拍照。

2．5體式學計數

使用Leica普光顯微鏡結合MBF體視學計數系統及其SteroInvestigator(Version8)軟件對SN的DA能神經元進行計數。在SN區所有連續切片中每6張取1張作為計數樣本。統計學處理:應用SPSS16．0統計軟件包，所得數據均以x珋±s表示。組間比較以t檢驗判斷，P＜0．05為差異有統計學意義。

結果

1小鼠運動速度改變為了從行為學角度觀察CCL2處理是否能對黒質造成影響，我們使用檢測動物行為學改變的經典方法曠場實驗來研究小鼠的運動速度是否有改變。實驗組(CCL2)和對照組(PBS)在注射前0d及注射后7d、14d、21d、28d于相同環境中檢測，結果顯示:實驗組(CCL2)在所有時間點內呈整體下降的趨勢，表現出運動遲緩、不愛活動，對曠場的探索行為減少。注射后28d時實驗組(CCL2)小鼠5min內平均運動速度明顯低于對照組，降低了37．9%(P=0．0087)，其它時間點則無統計學意義(Fig．1)2CCL2對黒質DA能神經元有損傷作用注射后7d和14d時實驗組和對照組相比黒質TH陽性神經元形態、數量差異不明顯;注射后21d時實驗組與對照組相比可見TH陽性神經元數量與對照組相比減少了25．2%，有顯著性差異(P=0．035)、染色變淺、纖維減少;而注射后28d時，實驗組TH陽性神經元數量與對照組相比減少的更為明顯，減少了45．4%(P=0．0049，Fig．2)

討論

本研究通過立體定位方法直接注射趨化因子CCL2到小鼠黒質，通過多個時間點的檢測，觀察到小鼠在給藥后28d開始行為學發生異常改變，包括運動速度的減慢，同時免疫組織化學染色和體視學計數方法發現小鼠黒質致密部的DA能神經元損傷并減少，說明CCL2本身就可以損傷黒質DA能神經元。同時，我們的研究也觀察到，DA能神經元丟失是逐步的，是隨著CCL2注射時間推移而增加的，當丟失到達一定程度時才對小鼠的行為造成影響，出現PD樣表現，這提示CCL2對神經元的損傷具有“進行性”的特點，而這些正是PD病程的關鍵特征，因此CCL2也可用于帕金森病模型的制作。本研究觀察到的這種CCL2對黑質DA能神經元進行性損傷可能與小膠質細胞有關聯。近年來帕金森病與神經炎癥相關的觀點日益受到人們的重視［8］，目前已經知道，介導腦內炎癥的主要是小膠質細胞和星形膠質細胞。其中小膠質細胞是中樞神經系統內的免疫感受與效應細胞，生理情況下，小膠質細胞起著清除代謝產物、維護組織穩定的作用［9］。當腦組織受到感染、外傷、缺血或毒性物質侵害時，小膠質細胞即被活化，通過釋放多種生物活性物質來發揮多方面的作用，包括促進炎癥及抑制炎癥的雙向復雜作用［10］。CCL2的特異性受體CCR2在中樞神經系統主要表達在膠質細胞上，CCL2通過與之相結合在小膠質細胞的募集和炎癥擴散上起作用［11，12］，CCL2可能募集更多的小膠質細胞到黑質從而損傷黑質多巴胺能神經元。以往的研究表明，黑質DA能神經元表達CCL2和其受體CCR2［13，14］，黑質內注射CCL2(50ng)可增加DA能神經元的興奮性，導致DA能神經元迅速釋放DA［15］，本實驗所注射的CCL2的計量為500ng，可導致DA能神經元更為長久劇烈的興奮性和DA的釋放，也可能是DA能神經元損傷并減少的因素之一。

作者：周巖 王丹瀅 孫曉紅 徐群淵 單位：首都醫科大學神經生物學系