熒光定量PCR技術在草莓上的應用范文

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《北京農學院學報》2016年第3期

摘要:

【目的】為優(yōu)化熒光定量pcr技術體系并在草莓研究中應用.【方法】以二倍體草莓為試材,草莓當中兩個βG肌動蛋白基因家族成員Actin1和Actin2為內參基因,對比分析10μL和20μL反應體系條件下熒光定量PCR擴增反應.【結果】內參基因引物組合Actin1的擴增效率等指標優(yōu)于AcGtin2;10μL反應體系中的擴增效率等指標優(yōu)于20μL反應體系;內參基因Actin1在10μL反應體系下是草莓最優(yōu)的熒光定量PCR技術體系.【結論】優(yōu)化了草莓熒光定量PCR體系并應用該技術體系檢測了草莓CrRLK1Ls家族成員的時空表達情況.

關鍵詞:

熒光定量PCR;內參基因;草莓;擴增效率;CrRLK1Ls 

實時熒光定量PCR(RealGtimePCR)技術是在普通PCR反應中引入一種熒光化學物質,根據(jù)檢測到的即時熒光信號代表特異性擴增產物的量,并據(jù)此計算初始模板的量,實現(xiàn)基因表達的定量檢測[1].具有高靈敏度、高重復性、高安全性和高準確性等優(yōu)點,廣泛應用于臨床疾病[2G6],食品安全[7]和動物試驗[8,9]等領域,植物領域已在玉米[10]、觀賞海棠[11]、葡萄[12]、紫蘇[13]等植物上廣泛應用.實現(xiàn)了普通PCR從定性到定量的飛躍.熒光定量PCR技術通常需要采用一些表達穩(wěn)定的基因(內參基因)作為內部參照,去除不同處理在細胞數(shù)量、提取條件和上樣過程等方面存在的誤差.常用的內參基因有甘油醛G3G磷酸脫氫酶基因、βG肌動蛋白基因、β2G微球蛋白基因、18SrRNA基因等[14].但是,這些內參基因的表達量并不總是恒定不變的,在不同組織、發(fā)育階段和反應條件下會有變化.因此,為了獲得準確可信的基因表達量,在應用熒光定量PCR技術時需要從引物特異性、內參基因和反應條件穩(wěn)定性等方面優(yōu)化改進.Feronia家族是古老而又保守的CrRLK1Ls基因家族的亞家族[15],草莓中有7個成員.目前,植物中關于該家族的研究多集中在擬南芥中,在園藝植物中的研究相對較少,未見相關報道.本研究利用優(yōu)化的實時熒光定量PCR技術分析Feronia家族7個成員的時空表達特征,為今后研究該家族調控草莓生長發(fā)育的分子機制奠定基礎.

1材料與方法

1．1植物材料和儀器

以北京農學院組培中心栽培的二倍體草莓為試驗材料,按照草莓果實不同發(fā)育時期,分為綠果、白果、片紅和全紅四個時期,每個時期測定15個果實樣品,然后將樣品隨機分成3組,3個生物學重復;草莓不同組織取樣,根取幼嫩的白根、莖取幼嫩的匍匐莖、葉取幼嫩的新葉、果取綠果期果實,每個組織設置3個生物學重復,液氮速凍植物材料并G80℃冰箱保存?zhèn)溆?主要儀器型號為LightCycler96熒光定量PCR儀(德國羅氏公司).

1．2總RNA提取和cDNA的合成

草莓不同組織和發(fā)育期(根、莖、葉,綠果、白果、片紅果和紅果)總RNA的提取按照OMEGA植物RNA提取試劑盒法,具體步驟:在液氮充分研磨樣品,取100mg研磨好的樣品轉入1.5ml離心管,然后加入含1%βG巰基乙醇的裂解液500μL和PlanGtaid50μL,混勻,3~5min55℃水浴;然后離心10min,轉速為12000g,轉移上清液到一個新的離心管中;加入0.5體積的無水乙醇,立即上下翻轉混勻;轉移混合物至吸附柱中,室溫環(huán)境中放置2min,離心30s,轉速為12000g,棄掉廢液;加500μL去蛋白液,室溫環(huán)境中放置30s,離心30s,轉速為12000g,棄掉廢液;加700μL漂洗液,離心30s,轉速為12000g,棄掉廢液,重復本步驟;將吸附柱放回空收集管中,離心2min,轉速為12000g,盡可能除去漂洗液,防止漂洗液殘留乙醇抑制下游反應;將吸附柱放入一個RNasefree離心管中,加30~50μLRNasefreewater(事先在70G90℃水浴中預熱),室溫放置2min,12000g離心1min;收集到RNA放入－80℃保存?zhèn)溆?草莓不同組織總RNA反轉成cDNA按照ReGverseTranscriptaseMGMLV(RNaseHG)試劑盒(TaKaGRa)進行,具體步驟:5μL純化的總RNA與1μL的Oligo(dT)18Primer(50μmol/L)混合,70℃溫浴10min,冰上2min,加入5×MGMLVBuffer,dNTPMixGture,RNaseInhibitor,RTaseMGMLV,用ddH2O水定容并混勻,總體積為20μL.反應條件為:先在42℃放置孵化1h,然后70℃溫浴15min,最后在4℃冷卻,反轉錄合成cDNA鏈,通過電泳檢測,將反轉錄合格的cDNA保存于－20℃冰箱.

1．3內參基因引物設計和檢測

以二倍體草莓研究常用的兩個βG肌動蛋白基因(βGactin,ACTB)Actin1和Actin2作為內參基因,在NCBI上的登錄號分別為XM_011471474.1和XM_004306544.2,用軟件Primer5.0分別設計3對引物,分別從中選出最優(yōu)的1對引物組合Actin1和AcGtin2,由上海生物工程公司合成.Actin1GF:GCGACAATGGAACTGGAATGG;Actin1GR:GACAATTTCCCGTTCAGCAGTG;Actin2GF:TGGGTTTGCTGGAGATGATG,AcGtin2GR:CAGTTAGGAGAACTGGGTGC.以綠果期cDNA為模板,普通PCR技術克隆兩個內參基因片段,通過瓊脂糖凝膠電泳結果檢測內參基因引物.普通PCR技術反應體系為:10×擴增buffer4μL,dNTP0.8μL,cDNA模板1μL,TaqDNA聚合酶0.2μL,Mg2+1μL,ddH2O3μL,退火溫度54℃.陰性對照不加模板.

1．4實時熒光定量PCR反應體系的優(yōu)化

熒光定量PCR采用SYBRpremixEXTaqTMreagent試劑盒(TaKaRa),按說明書進行.為確定最適的內參基因和反應體系,本試驗設置4組實時熒光定量PCR反應.第一組:內參基因為Actin1,反應體系為10μL;第二組:內參基因為Actin1,反應體系為20μL;第三組:內參基因為Actin2,反應體系為10μL;第四組:內參基因為Actin2,反應體系為20μL.本試驗的模板為綠果時期的cDNA,分別進行10倍梯度稀釋(1、10倍、100倍、1000倍、10000倍)開展熒光定量反應,然后繪制標準曲線.具體反應體系見表1.實時熒光定量PCR反應程序為:95℃預變性3min;94℃變性20s,退火溫度54℃,時間為20s,最后72℃延伸,時間為20s,共40次循環(huán).每次循環(huán)第3步進行熒光信號采集,最后退火至65℃,每隔30s上升0.5℃,至95℃變性1min.檢測其熒光值,繪制溶解曲線.qRTGPCR反應于德國羅氏LightCycler96熒光定量PCR儀上進行.cDNA標樣和待測樣均設置3次重復.

1．5草莓FERONIA家族時空表達

采用優(yōu)化的實時熒光定量PCR的方法,檢測Feronia基因家族成員在草莓根、莖、葉、果實等不同組織相對表達量,檢測在綠果、白果、片紅和紅果等不同時期相對表達量,反應體系同上.數(shù)據(jù)采用SPSS13．0進行方差分析,Excel2007作圖.

2結果與分析

2．1總RNA提取結果

高質量的RNA是實時熒光定量PCR基礎,利用OMEGA植物RNA提取試劑盒法提取總RNA,用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的總RNA進行完整性檢測,在紫外成像系統(tǒng)上拍照分析,電泳結果如圖1所示,在28S和18S處呈現(xiàn)2條明亮的帶,無明顯脫尾現(xiàn)象,表明提取的總RNA完整性好,純度高.用NanoDrop2000超微量分光光度計進行純度和濃度檢測,如表2所示,草莓不同組織和發(fā)育階段總RNA濃度均在300μg/mL,OD260/OD280值在2左右.說明本試驗提取的總RNA質量、純度和產量均滿足試驗要求,幾乎不存在多糖等雜質污染,反轉后的cDNA可以做熒光定量PCR.

2．2內參基因引物

如圖2所示,在退火溫度為54℃的條件下,內參基因引物組合Actin1和Actin2分別在240bp和230bp擴增出單一明亮的條帶,陰性對照顯示無二聚體產生,說明兩個內參基因均可應用于后續(xù)試驗。內參基因Actin1目的條帶亮度高于Actin2的亮度,初步說明Actin1擴增效率高于Actin2,可能更適用于熒光定量PCR.

2．3不同反應體系熒光定量PCR結果

本試驗設置了4組不同的熒光定量PCR反應體系:Actin1G10μL體系、Actin1G20μL體系、AcGtin2G10μL體系和Actin2G20μL體系,4組不同的熒光定量PCR結果的擴增效率、回歸系數(shù)和斜率數(shù)據(jù)見表3.可知4組反應體系處理的的擴增效率均在90％~102％之間,其中Actin1G10μL體系的擴增效率最接近100％,Actin1G10μL、Actin1G20μL、Actin2G20μL3組處理的回歸系數(shù)均為0．998以上.說明Actin1G10μL是最優(yōu)的反應體系,可以用于草莓基因的實時熒光定量PCR技術。

2．4FERONIA家族在不同組織中的表達

試驗檢測Feronia家族7個成員在草莓不同組織中的表達情況.實時定量PCR結果顯示(圖3),該家族7個成員在草莓根、莖、葉和果實中均能表達,并且在根和葉片中的表達量相對較多,可能在葉片和根組織中承擔較多的功能.在擬南芥中的研究認為,Feronia能夠促進根毛和葉片的生長[16,17]. 

2．5FERONIA家族成員在不同發(fā)育時期的發(fā)表

本試驗檢測Feronia家族在草莓果實不同發(fā)育時期的表達情況.RealGtimePCR結果顯示(圖4),Feronia亞家族在果實發(fā)育綠、白、片紅和全紅四個時期均有表達,表達量隨著果實發(fā)育而降低,尤其是果實發(fā)育前期降低明顯.這說明,該基因對果實發(fā)育可能有負調控作用,在擬南芥中的研究認為,FerGonia能夠抑制授粉期間花粉管的生長[18].

3討論

不同植物、組織和不同發(fā)育期適合做內參基因的候選基因是不同的,要獲得高質量的實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)的關鍵步驟就是確定穩(wěn)定高效的內參基因.本試驗對比研究了草莓中常用的兩個βG肌動蛋白(βGactin,ACTB)家族成員作為內參基因,經過篩選,均無引物二聚體,特異性強,Actin1作為內參基因特異性好和擴增效率高,是適合的草莓內參基因.熒光定量PCR費用昂貴,為降低試驗成本,試驗將常規(guī)的20μL反應體系減少至10μL,擴增效率保持在90％~102％之間,標曲的斜率都保持在G3~G3．5之間,尤其是Actin1G10μL反應體系的擴增效率為101．5％,比較研究發(fā)現(xiàn),10μL反應體系的熒光定量PCR反應擴增效率均高于20μL反應體系.同時,熒光定量PCR反應體系的引物濃度影響試驗結果,如果引物濃度太低,使PCR反應不完全,若引物濃度太高,則增加發(fā)生錯配以及產生非特異的產物的幾率.這說明Actin1G10μL反應體系是草莓熒光定量PCR優(yōu)化的理想體系.草莓Feronia家族功能的研究主要集中在擬南芥中,在果樹上的研究未見相關報道.其在擬南芥中的功能研究主要集中在兩個方面,一個方面是該蛋白家族膜外Malectin結構域作為受體與配基的互作研究;一方面是膜內激酶結構域參與介導下游的信號轉到作用,調控植物細胞的生長發(fā)育[16G19].2014年,Haruta等在SCIENCE雜志撰文,報道了FERONIA的膜外Malectin結構域作為受體與快速堿化因子RALF直接互作,使膜外的PH值升高,抑制細胞的生長.該文章通過FERONIA的突變體fer開展研究,主要表型是根毛生長受到抑制.2014年,Duan等在NatureCommunication也報道了團隊的最新研究進展,詳細研究了FERONIA通過尿苷酸交換因子GEF與ROSp相互作用,調控質膜活性氧的濃度變化,參與介導植物細胞的生長發(fā)育.研究發(fā)現(xiàn),突變體fer花粉管表現(xiàn)出生長過度和不破裂,影響精細胞的釋放,造成花粉受精失敗.該課題組還開展了很多相關的研究,比如FERONIA與內源激素ABA的響應,與生長素IAA、與赤霉素GA,與油菜素內脂BR等的響應.總的來講,該家族對植物的生長發(fā)育有兩方面的影響,一方面是促進生長,表現(xiàn)在使子葉、子葉下胚軸、種子和氣孔細胞生長變大;另一面是抑制生長,表現(xiàn)在抑制根毛的生長和花粉管的伸長等.該家族與激素的關系,一般認為,該家族的基因表達與生長素、細胞分裂素,赤霉素等正調控,與ABA等負調控.Feronia家族在草莓中的時空表達情況顯示,該家族應該在草莓的生長發(fā)育過程中具有重要作用,尤其是對果實的發(fā)育.

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作者:張卿 邢宇 曹慶芹 秦嶺 單位:北京農學院農業(yè)應用新技術北京市重點實驗室