熒光膜片鉗新技術的應用范文

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《生物化學與生物物理進展雜志》2016年第二期

摘要

熒光膜片鉗(patch-clampfluorometry，PCF)是將離子通道蛋白局部的構象變化和門控緊密結合，實時記錄同一膜片上離子通道的熒光和電流信號的創新型生物物理學技術，其特點是將經典的膜片鉗和現代光學記錄結合起來，實時同步完美呈現離子通道執行其功能時的蛋白質構象信息．與研究結構的X射線和冰凍電鏡不同，熒光膜片鉗提供離子通道處于真實細胞膜生理環境并執行功能的實時動態結構信息．隨著新的光學技術、顯微成像技術、圖像分析技術等的進步，大大地擴展了熒光膜片鉗技術的記錄范圍、分辨精度及敏感度，使研究者以前所未有的時空分辨率來實時觀察和記錄離子通道蛋白的結構變化．

關鍵詞

熒光膜片鉗，熒光分子，蛋白質構象，膜蛋白，門控

離子通道和轉運蛋白是一類復雜的細胞膜蛋白，其存在使得細胞-細胞間以及細胞-環境間離子交換及相關的信息交流成為可能，其功能的執行同蛋白質結構變化息息相關．離子通道的開放和關閉的過程稱為門控，離子通道門控的過程是以蛋白質構象重排的形式實現的，精確地觀察解析構象變化及其在信號轉導中的作用是揭示通道蛋白功能的分子機制的關鍵．長期以來，對離子通道門控的研究通常采用膜片鉗這個“金標準”技術來實現．隨著對離子通道研究的深入，簡單地記錄離子電流顯示出了它的局限．首先，離子電流反映的是通道在開放狀態下的功能指標，它無法直接反映通道蛋白在門控的過程中結構變化的特性；其次，由于離子電流僅存在于開放狀態，在多重關閉狀態以及過渡狀態的信息是缺失的．熒光膜片鉗(patch-clampfluorometry，PCF)[1-4]是用來研究這些缺失的信息的一種新的實驗技術．熒光膜片鉗借助特異位點熒光記錄使在細胞膜環境下直接實時觀察蛋白質分子活動成為可能，實現同時記錄細胞膜片上的離子通道蛋白的局部結構變化和功能狀態．為了獲取各種與功能相對應的結構構象信息，熒光膜片鉗利用小熒光分子作為定位探針，熒光團被嵌入到通道蛋白或通道配體分子的特異位點(圖1)，研究者可同時記錄特異位點的實時熒光和電流[5-6]．熒光膜片鉗技術的應用為膜蛋白及相關轉運蛋白、膜受體蛋白結構功能的關系研究提供了一個全新的工具．

1熒光電壓鉗技術

在過去的幾十年里，電生理技術的應用使離子通道的功能和調控被廣泛研究，通道蛋白的詳細結構信息則采用X射線和冰凍電鏡的方法獲得，特別是冰凍電鏡技術的使用，在近兩年提供了大量存在于膜環境中的通道蛋白的結構信息．然而，這些方法要么單純跟蹤功能變化，要么只顯示蛋白質結構，沒有一種方法可以直接將離子通道的構象變化和功能狀態結合起來．為了克服這一缺陷，不同的光譜技術被嘗試著與經典的電生理學方法結合，將同時檢測通道功能和構象變化直接聯系起來．20世紀90年代，Dr.Isacoff等[7]建立了熒光電壓鉗(voltage-clampfluorometry，VCF)技術，研究鉀離子通道蛋白的電壓敏感域在電壓激活過程中的運動．最初熒光電壓鉗用來記錄爪蟾卵母細胞全細胞模式下的功能性離子通道．在實驗前幾天，編碼包含半胱氨酸離子通道蛋白的mRNA通過顯微注射，表達于非洲爪蟾卵母細胞，隨后將卵母細胞浸入包含可與半胱氨酸反應的熒光團的溶液中，在卵母細胞胞外暴露的半胱氨酸殘基即可與熒光團分子通過形成共價鍵被熒光標定．通常選取卵母細胞富含色素且胞體組分中產生的自發熒光較少的動物極進行熒光記錄．實驗中電壓鉗記錄電壓敏感離子通道的激活及檢測通道的功能狀態，熒光變化直接記錄暴露于細胞外側的蛋白質結構的實時運動，其開發者將這一技術命名為熒光電壓鉗(VCF)．隨著該項技術的發展，結合熒光電壓鉗和熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)技術，研究人員證明了電壓敏感鉀通道的第四跨膜域在電壓門控通道的激活過程中經歷了原子水平分辨率的轉動和可能的平移運動[7-9]．同時熒光電壓鉗也被應用到不同家族的離子通道及膜轉運蛋白、受體蛋白的研究[10-17]．然而，研究者發現熒光電壓鉗受其電壓鉗制模式和敏感性的限制，無法解決對于離子通道胞內部分的結構變化問題．

2熒光膜片鉗技術

2．1熒光膜片鉗技術及其應用2000年，受熒光電壓鉗的啟發，Zheng與Zagotta[1]共同努力，一種新的結合熒光記錄和內面向外膜片鉗模式的熒光膜片鉗(PCF)技術應運而生，該技術最初設計解決環核苷酸門控(CNG)通道蛋白與cGMP結合所產生的化學能如何驅動通道被激活的問題．首次報道的熒光膜片鉗研究中，將馬來酰亞胺用Alexa488熒光標記后，觀察其修飾CNG通道蛋白上的半胱氨酸(胞內C端環核苷酸結合域的C481位點)的作用，通過記錄熒光信號判斷修飾所引發的通道蛋白結構變化，從而影響cGMP與CNG通道蛋白結合以及通道的激活．實驗時，采用一根開口大約為幾微米的拋光玻璃電極，封接表達于包含半胱氨酸的離子通道蛋白的細胞膜表面，通過拉回玻璃電極使細胞表面撕下的一小塊細胞膜附著于玻璃電極尖部，熒光團標記和記錄都在這一平方微米尺度的細胞膜片上進行．熒光膜片鉗允許在通道蛋白的胞內及胞外兩側記錄熒光信號．由于熒光信號記錄的是從一小片游離膜上包含的離子通道信息，由胞內組分所產生的自發熒光造成的污染被除去．這使得熒光信號的信噪比增加，從而得到更高的分辨率．當結合高度敏感性、低噪聲的熒光探測器，熒光膜片鉗可以記錄到單獨一個蛋白質分子，實現單分子實時記錄．基于內面向外的熒光膜片鉗被稱為經典熒光膜片鉗，而后不同的研究小組也陸續報道了全細胞模式、細胞貼附模式的熒光膜片鉗，作為熒光膜片鉗技術的擴展．Yang等[6]將熒光膜片鉗技術應用到HEK全細胞模式下溫度敏感TRP離子通道的溫度激活的實驗研究中，采用全細胞模式，同時記錄通道電流和熒光信號，使得熒光膜片鉗最初的大部分優勢得以保留，在電流發生階段，全細胞熒光膜片鉗只記錄胞外標定的熒光團．到目前為止，熒光膜片鉗被應用于CNG通道門控及構象變化關系[1,18]、CNG通道蛋白亞基配比[19]、HCN通道在超極化激活下配體結合和門控間的關系研究[20-23]．Mony等[24]應用熒光膜片鉗結合熒光電壓鉗，對質子通道Hv1的門控研究揭示了通道激活過程中S1和S4的結構重排，指出兩部分在通道活動中既相互獨立又相互影響的特性．最近Nomura等[25]將熒光膜片鉗技術應用于細菌源的機械刺激敏感通道在人工構建的脂質膜中重組的方向特性研究．毫無疑問，膜片鉗的多種鉗制模式使開發熒光膜片鉗新方法具有了許多優勢．

2．2熒光膜片鉗技術優勢熒光膜片鉗技術對胞膜上離子通道的特異位點采用熒光標記，研究者可以直接觀察發生在特定通道結構上的實時構象重排．半胱氨酸通過基因突變技術被引入到通道蛋白的興趣位點，如果必要，通道蛋白上原有的半胱氨酸可以通過基因突變被全部替換以確保所有記錄信號的特異性．半胱氨酸殘基作為與巰基特異反應的熒光團的定位點，允許特異位點熒光團標定．電流和熒光信號被同時從同一組離子通道蛋白記錄，這是熒光膜片鉗與熒光電壓鉗的主要區別之一．電流信號，作為通道開放和離子流動的結果，可做為通道功能的指示器．當半胱氨酸附近的蛋白質結構重排影響到熒光團的量子產出、遷移率、與鄰近的熒光團的距離變化等因素時，熒光發射也發生改變．這樣，熒光團可作為蛋白質構象變化的高度敏感的報告基團．因為熒光信號不像離子電流信號那樣依賴于離子通道孔區的開放，熒光記錄為探究離子通道蛋白到達開放狀態前的構象變化的時空信息提供了一個新的手段．熒光膜片鉗作為一種全新的研究正常功能下通道蛋白分子活動的方法，可以廣泛應用于任何通道類型，甚至可以嘗試非通道的膜蛋白，如轉運蛋白、受體蛋白等．研究也表明，熒光記錄也可以成為高通量藥物篩選中電流記錄的有效替代[26]．與直徑1mm的卵母細胞相比，分離的膜片要小得多．那么為什么還能得到足夠強的熒光信號呢？這其中的原因主要有兩個．第一，在HEK細胞膜上可以高密度地表達通道蛋白，對許多離子通道而言，從一片分離的細胞膜上可以得到幾百到幾千個通道分子，因為敏感的光學探測器(如CCD相機)可以觀察單個熒光分子，成百上千個熒光分子所發出的熒光在檢測上自然沒有問題．第二，因為膜片很小，這樣就可以使用高采光效率的光學鏡頭(如40倍數值孔徑NA值大于1.4的高分辨物鏡)采集整個膜片上所有的熒光信號．與之相比，卵母細胞雖然很大，但大多數熒光都沒有被收集到．熒光膜片鉗記錄提供了優越的敏感性和時間分辨率，而且同熒光電壓鉗記錄相比(圖2)，熒光膜片鉗可以直接控制胞內環境，優勢如下：第一，可以面對離子通道胞內一側并對相關區域進行標定；第二，排除了由胞內環境所造成的自發熒光，熒光探測敏感性大為提高；第三，可以施加胞內配體及通道調節分子來調節通道的門控；第四，電流記錄具有更高的時間分辨率[1,27]．熒光膜片鉗利用小的熒光分子作為定位分子探針，這些熒光團被嵌入到通道蛋白或通道配體分子的特異位點，熒光發射過程對熒光團周圍環境變化具有高度的敏感性，如疏水性、電荷或是偶極、空間制約等等，在熒光團附近的通道蛋白構象重組影響這些參數會改變其熒光發射，這種變化可以從記錄到的熒光強度、顏色、各向異性等指標的變化中反映出來．該技術的優勢在于其將通道功能狀態與通道結構變化完美關聯起來[1,5-6,27]．

2．3熒光膜片鉗結合FRET技術的應用隨著熒光膜片鉗技術的發展，熒光膜片鉗結合熒光共振能量轉移(FRET)等技術使研究者獲得了更多的關于結構變化的細節部分．FRET是被廣泛應用于蛋白質-蛋白質相互作用、域-域相互作用及構象重排的有力工具．結合FRET技術監測通道構象變化時，通道蛋白兩個或更多位點被供體和受體熒光團同時標記，熒光共振能量轉移發生．FRET可以敏感地探測微小距離的變化，使其成為離子通道研究的有力工具[28]．Miranda等[29]應用熒光膜片鉗并結合FRET技術檢測BK(大電導、電壓及鈣離子依賴的鉀通道)通道蛋白構象重排，觀察到了鈣離子的結合誘發通道門控環區域的蛋白質構象發生變化，較之于應用X射線測定離體蛋白的晶體結構后所預測的構象變化幅度要大得多．應用FRET，Yang等觀察到TRPV1外孔區在熱激活過程的結構變化：通過采用熒光素-馬來酰亞胺(FM)和四甲基羅丹明-馬來酰亞胺(TMRM)熒光標記位于溫度敏感TRPV1通道蛋白孔區的兩個半胱氨酸測定其FRET效率的變化，從而確定溫度激活過程引起孔區結構變化從而使通道開放[5-6]．新的小分子熒光團及過渡金屬離子的引入使得熒光檢測的范圍更廣、靈敏度更高．利用過渡金屬與小分子熒光團之間的能量轉移(tmFRET)，可以更加準確地記錄蛋白局部的微小結構變化．新的超敏感光學探測器如電荷耦合(CCD)相機為熒光膜片鉗技術的更新提供了便利基礎，而光譜儀(spectrograph)的引入極大地提高了熒光信號的分辨、分離及信息提取能力．

3結語

熒光膜片鉗技術是膜片鉗技術和光學記錄完美結合的一項創新型生物物理學技術，該技術利用蛋白質巰基可被氧化修飾的特點實現了實時動態檢測離子通道蛋白的結構和功能，從而達到同時記錄在同一膜片上的同一(組)離子通道的熒光信號和電流信號．這一技術可以應用于研究離子通道的結構和功能關系，也可應用于膜蛋白、轉運蛋白、受體蛋白等的動力學研究，甚至可以作為高通量藥物篩選的有效手段．但是，目前世界范圍內能夠成功應用此技術的實驗室仍然很少．無論是膜片鉗操作，還是熒光標記對于實踐者的技能操作要求都非常高，這也是目前為止阻礙這項技術得以推廣的主要挑戰．同時將熒光標記擴展到如熒光蛋白、小分子熒光團等更廣范圍，將使研究者有更多的選擇．只有這些問題都得到解決，伴隨著光學技術、成像技術的創新發展，熒光膜片鉗技術將會為研究者提供洞悉蛋白質結構功能的更進一步的微觀細節，而不斷更新的熒光膜片鉗技術必將為生命科學研究領域帶來新的曙光．

作者：程為 李玫 杜莎 鄭稢 單位：大連醫科大學腫瘤干細胞研究院