前表面熒光光譜法對食品質量分析范文

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摘要：前表面熒光光譜法（Front-FaceFluorescenceSpectrometry，FFFS）是基于分子被光子激發而產生熒光的特性，對非透明或非澄清的液體和固體樣品的表面分子所產生的熒光進行收集和測量的方法。前表面熒光光譜結合化學計量學方法常用于各類食品的質量評估與分析，具有前處理簡單、快速、靈敏度高、成本低、檢測限量低等優點。近年來此技術在國外應用較廣，國內也發展迅速。本文對前表面熒光光譜的基本原理、前表面熒光光譜分析中常用的化學計量學方法和國內外此方法在各種食品中的應用進展進行了綜述。前表面熒光光譜技術的開發與應用為食品質量評估與分析提供了新的方法和手段。

關鍵詞：前表面熒光光譜法，化學計量學，食品質量分析，快速檢測方法

隨著生活水平的不斷提高，飲食習慣、消費行為和食品供應鏈產業的不斷變化，人們更加重視食品的質量?？焖贌o損檢驗技術成為食品分析檢驗發展的一個重要方向。前表面熒光光譜法（Front-FaceFluorescenceSpectrometry，FFFS）用于食品分析檢驗時具有快速、靈敏和無損的優點，是一項具有巨大應用前景的新型檢測技術。FFFS法是基于分子被光子激發而產生熒光的特性，對非透明或非澄清的液體和固體樣品的表面分子所產生的熒光進行收集和測量的方法。FFFS的激發光無法像傳統的透射熒光光譜法一樣穿透樣品，而是僅對樣品表面的分子進行熒光的激發，樣品和激發光之間必須形成一個特殊的夾角，以確保數據免受激發光反射的干擾（圖1）。熒光光譜法因其數據量大、復雜且高維的特性，一般結合使用化學計量學進行數據挖掘和處理，以實現對樣品的分析檢測。FFFS法避免了復雜的樣品前處理程序，具有快速、靈敏的特點，在食品的質量分析中應用前景廣闊，特別適合大量食品樣品的質量篩查，是一種經濟有效的分析檢驗方法。本文主要闡述了FFFS的分析基本原理以及其在國內外食品研究中的應用現狀和發展趨勢。

1.前表面熒光光譜

1.1食品中熒光的物質基礎食品營養豐富成分復雜，多以渾濁、非透明或非澄清的液體和固體等狀態存在，如酒類、油脂類、肉類、谷物類、乳類、魚類、面包糕點類、蛋類和水果類等食品。相較于傳統的熒光光譜法只能用于透明樣品的局限性，FFFS基于食品樣品表面的熒光信號進行分析，免去了繁雜的樣品前處理步驟，優勢明顯。食品中含有多種熒光物質，如維生素、氨基酸、蛋白質、核酸等，利用不同樣品中的某些共有物質及其相對含量的差異可以對樣品進行摻假鑒別[1-2]和質量分類[3]；也可針對食品中的某些特殊物質（如紅酒中的多酚[4]）進行定量分析；另外，對于某些本身無熒光但因熒光猝滅效應或共振能量轉移效應的物質，理論上也可通過此方法進行判定和分析[5]。大多數食品成分復雜（如魚肉和畜禽肉[6]），需利用FFFS獲得的熒光光譜，結合化學計量學方法對熒光數據中細微差異進行提取和分析，與化學計量學方法的聯用大大擴大了FFFS在食品質量分析中的應用范圍。

1.2前表面熒光光譜法分析的基本流程熒光光譜法容易受到濃度、分子環境和光學散射的影響。濃度與熒光強度相關，分子環境如溶劑的極性、熒光猝滅溫度、pH、熒光的內濾效應和自吸現象等會對熒光信息的表達產生影響。光學散射分為瑞利散射和拉曼散射，拉曼散射峰的波長與激發光波長及頻移的關系為其中，λ𝑅𝑎𝑚𝑎𝑛為拉曼峰的波長，λex為激發光的波長，Δσ為頻移(激發光與拉曼光的波數差值)，由此式可預測溶劑拉曼散射峰的位置，了解其對熒光光譜的影響，以選擇實驗最佳的溶劑和測定波長[7]。FFFS由于特殊的成像特性，基本能夠避免熒光的內濾效應和自吸現象，故其靈敏度（發射熒光強度）比透射熒光光譜高。FFFS的分析步驟包括：進行樣品熒光信息的收集和整理，并通過等高線圖譜和三維熒光光譜圖（圖2）等對簡單的熒光特征峰等進行判斷和歸類分析；依據實驗目的和熒光數據的特點選擇合適的化學計量學方法進行數據處理；結合實際情況與科學性，分析并得出結論。

2.前表面熒光光譜分析中常用的化學計量學方法

化學計量學是一門通過統計學或數學方法將對化學體系的測量值與體系的狀態之間建立聯系的學科，在前表面熒光光譜分析中有著舉足輕重的作用。通過化學計量學可以對數據量大、復雜和高維的熒光數據進行選擇、簡化和降維，具有在復雜的數據中提取光譜數據與判斷因變量之間存在的內在關系的功能。常用于前表面熒光光譜分析的化學計量學方法主要有二維統計學方法、模式識別法、二階校正法等。2.1二維統計學方法（Two-DimensionalStatisticalMethod）二維統計學方法，即將三維圖譜中的熒光信息以二維的形式離散化表示，基于離散化的數據利用統計學方法表示其分布特征（線性特征），通常使用平均值、標準差、原點矩，x與y的相關系數等。二維統計學方法常應用于簡單的FFFS分析，如：求樣品中某單一量。

2.2模式識別算法（PatternRecognitionAlgorithm）模式識別算法用于提取三維光譜中的最符合研究目的的熒光信息，便于復雜成分的鑒別和分析。常見的方法有主成分分析法（PrincipalComponentAnalysis，PCA）[8]、Fisher線性判別法（LinearDiscriminantAnalysis，LDA）[9]和獨立成分分析法（IndependentComponentAnalysis，ICA）[10]。PCA是將原先變量重新組合成一組新的互相無關的綜合變量，同時可根據熒光的特征，從中提取較少的盡可能反應原變量信息的變量，也是一種數學降維方法；LDA是另一種數據降維的方法，既考慮了各類參考總體出現的概率大小，又考慮了因誤判造成的損失大小，比較適合在樣本數量較少情況下進行判別；ICA是一種將互相獨立但混雜的熒光信號解混并分析的一種化學計量學方法，它與PCA的差別是PCA僅適用于高斯分布而ICA適用于多數統計學運算?；瘜W計量學中的（偏）最小二乘法、奇異值分解等方法通常與模式識別方法結合使用。

2.3二階校正法（Second-OrderCalibrationMethod）利用二階校正法對前表面熒光數據進行分析處理，可分離樣品中多種熒光物質，也可對存在未知物質或干擾物的多個樣品進行多組分直接定量分析，避免了樣品復雜的前處理和多次建模分析的繁瑣流程，使數據處理過程更加省時、高效。由一系列向量構成的矩陣的數據稱為二階數據。FFFS的激發-發射矩陣（Excitation-EmissionMatrix，EEM）數據屬于二階數據，目前對于二階數據主要的處理方法有直接求解法和三線性分解法。2.3.1直接求解法直接求解法常見有廣義秩消因子法（GeneralizedRankAnnihilationFactorAnalysis，GREM）和直接三線性分解法(DirectTrilinearDecomposition，DTLD)。GREM主要用于一個校準分析體系和一個未知組分的分析體系[11]；DTLD目的是得到最小二乘的解，可以對多個樣品體系進行線性優化，但常因出現虛數解而失效。直接求解方法適用于信噪比較高、組分數難以準確估計的化學體系[12]。2.3.2三線性分解法三線性分解法常見有平行因子分析法（ParallelFactorAnalysis，PARAFAC）、交替三線性分解法（AlternatingTrilinearDecomposition，ATLD）、自加權交替三線性分解法（Self-weightedAlternatingTrilinearDecomposition，SWATLD）、N向偏最小二乘法（N-waypartialleastsquares，N-PLS）、多元曲線分辨交替最小二乘法（MutivariateCurveResoution-aternatingEastSuare，MCR-ALS）。PARAFAC是最常見的三維數據處理方法，可以完全識別具有足夠多的三維變量的樣品體系，，但普遍存在的缺點是收斂速度較慢，對噪聲或模型偏差較敏感[13]；ATLD基于最小二乘原理和遞次求近法的改進，較PARAFAC具有更快的收斂速度，在噪聲或模型偏差的情況下仍具有較高準確性[14]。SWATLD基于ATLD，是一種具有快速收斂速度且對干擾因素不敏感的穩定的方法。SWATLD在處理因子數量不同的分析體系時（不少于真實因子的數量），性能十分穩定，它可以不需要像PARAFAC那樣花費大量的時間和精力來精確地確定所研究的分析體系中的基本因子的數量，是使用最廣泛的化學計量學之一[15]；N-PLS由展開偏最小二乘法(Unfolded-PartialLeastSquares，U-PLS）方法發展而來，N-PLS較于其它的化學計量學方法穩定性更高，但一般不單獨使用，結合分散（L1-懲罰式）N向偏最小二乘法[Sparse(L1-penalized)N-PLSregression]的添加變量選擇降低預測誤差，從而提高N-PLS的可解釋性和可使用性[16]。MCR-ALS是一種較為新型的化學計量學方法，通?？梢愿郊蛹s束動態硬建模[17]與關聯（校準）與多組多路數據分析的結構模型[18]或者使用多線性模型來描述數據集的可能性，除此之外，還可以添加一個步驟：允許初步子空間的最大值的可能性預測來降低噪聲傳播效應，以防止較大的非同方差的誤差、減少直接選擇組分數目和初始估計的可能性[19]。

3.前表面熒光在不同食品中的應用進展

熒光光譜法被廣泛地運用于食品質量分析領域，普通熒光掃描在熒光光譜法中占主導地位，前表面熒光掃描雖然前景良好，優勢明顯，但是受限于技術發展，仍未被廣泛使用。普通熒光掃描在國內外的研究中主要用于物質的相互作用分析[20]和物質的定量分析[21]，下文主要歸納總結FFFS在食品領域的應用進展，如飲料類，油脂類，肉類，谷物類，乳制品類，魚類，面包糕點類，蛋類，水果類等食品都有相應的研究，表1列舉了FFFS在食品分析領域的應用，并對各類食品的前表面熒光檢測過程做了詳細描述。

3.1酒類葡萄酒成分包括80%~86%水，10~15%酒精和少量的多酚化合物，如黃酮類、花青素、酚酸和聚合單寧等[44]。多酚化合物常用于葡萄酒的前表面熒光分析中，用以葡萄酒種類鑒別和定量分析。但在研究多酚類化合物時，常在葡萄酒的自然pH條件下進行，不足以鑒別葡萄酒。pH改變可引起多酚的結構變化從而導致其熒光光譜顯著變化，為保證判定指標的單一性，可通過引入pH作為附加參數以提高葡萄酒的鑒別能力[45]。FFFS可應用于發酵過程中葡萄酒品種的鑒別和產地的分辯[22]，品種的鑒別利用咖啡酸；產地的分辨利用色氨酸和羥基苯甲酸衍生物；釀酒的鑒別利用兒茶酸和對羥苯基乙醇的相關熒光基團。也可應用于葡萄酒烈酒白蘭地的鑒別如對白蘭地與混合酒的鑒別[46]，其熒光物質如表兒茶素、兒茶素、咖啡酸、沒食子酸、香草酸的熒光特征峰通常在λex=240~290nm和λem=290~450nm區間，白藜蘆醇主要在λex=300~360nm和λem=330~400nm區間內[47]，綜上所述，酚類物質是基于前表面熒光對葡萄酒類的食品進行熒光分析的重要成分。啤酒的苦味來自于啤酒花中的ɑ酸[48]，但ɑ酸對熒光的貢獻不大，不能作為FFFS的判別標準，啤酒中熒光貢獻率最大的化合物為核黃素和芳香族氨基酸，因此，核黃素和芳香族氨基酸通常作為研究啤酒品質的判別依據[23]，芳香族氨基酸中，熒光貢獻率較大為色氨酸（λex=230nm，λem=350nm）和酪氨酸（λex=280nm，λem=345nm）。

3.2油脂類油脂類的研究主要集中在植物油方面，如橄欖油、大豆油、花生油和葵花籽油等，通常通過天然抗氧化成分，如酚類化合物、維生素（VB2、VE）和色素（葉綠素，類胡蘿卜素等）等對油脂進行品質評價[49]用以辨別區分油脂的種類。由于酚類化合物影響橄欖油的營養程度、感官特性和氧化穩定性，研究一般以油脂類的多酚化合物作為研究對象，橄欖油也可基于前表面熒光對總酚（TPC）進行定量[50]，但大多數研究方向仍然為品質鑒定（變化過程的研究）[51-52]和摻假判別[53-55]。研究的食品不僅僅局限于油脂，也可應用于成分中含有油脂的食品，如蛋黃醬則利用了油脂中的酪氨酸、色氨酸和核黃素來進行品質鑒定[56]。因植物油澄清透明，在使用熒光方法進行檢測時，既可以運用傳統透射熒光法又可使用FFFS，與傳統透射熒光相比，使用FFFS掃描獲得的光譜數據信號強度明顯提高（橄欖油樣品透射的發射熒光強度由2個光度單位增加到12個），可見內濾光現象對普通的熒光光譜法具有很大的影響，故在橄欖油的研究中，FFFS優于傳統透射熒光方法[57]。吳希軍[58]在其研究成果中利用熒光光譜對市售的八種植物油（大豆油、玉米油、橄欖油、稻米油、花生油、核桃油、葵花籽油和芝麻油）的三維熒光圖譜進行了闡述，較為系統地區分了植物油的種類。鑒于國情，地溝油問題時有發生，FFFS在對地溝油的檢測上有很好的應用前景。地溝油中成分混雜且具有不確定性，很難僅從單一指標來辨別，目前一般根據維生素和酚類抗氧化劑在反復煎炸的過程中的減少（被氧化）量來辨別煎炸油（UFO）在精制植物油（EVO）的摻假度[59]，故FFFS對地溝油的鑒定的前景巨大，利用價值非常高。

3.3肉類在研究肉類過程中，由于肉類的組織分布不均勻，容易造成結果的偏差。肉類應用于FFFS時需要預處理，常用的方法是利用液氮將肉類冷卻并研磨為粉末，具體的操作步驟以牛肉為例：將牛肉切成1cm3的立方塊，放入液氮中-80℃保存后研磨成牛肉的液氮粉末進行前表面熒光的研究[60]。研究肉類常見為牛肉，可對牛肉的胸縱肌、腹直肌和半腱肌進行辨別分類，通常以λex=335nm作為FFFS的最佳鑒別波長，而且FFFS往往是在肌肉樣本之間進行區分的最佳鑒別方式[61]。肉類的自體熒光成分復雜，利用λex=340nm的激發光對骨、軟骨、結締組織和肉分別進行熒光檢測，肉的熒光信號最弱，骨、軟骨和結締組織的熒光信號均較強，但有共性，即都有λex=390nm，λem=455nm和λem=475nm的尖峰[62]。肉類的成分復雜，通常用于前表面熒光分析的化合物有脂質氧化產物[63]、原卟啉IX[64]、膠原蛋白、NADH和色氨酸殘基等，也可以通過維生素、抗氧化劑以及天然色素分子對肉類進行研究[65]。在肉類的熒光研究中，通常使用干物質含量、脂肪含量、蛋白質含量、膠原蛋白含量等指標綜合判別肉的種類，理化檢測與熒光光譜法相結合共同表征則可以更好解決肉類的品質鑒別的問題。因成分復雜，干擾因素較多，肉類的熒光研究難度大，穩定性差，目前尚無對肉類中的物質進行定量的研究，但肉類于生活中甚為重要，故研究價值和潛力巨大。

3.4魚類魚類與肉類的研究方法類似，目前FFFS在魚肉方面的研究主要集中在新鮮度和質量評估方面。魚肉的脂質和蛋白質在各種相同的組織成分中分布相對均勻，因而可以將魚肉切成1cm3的肉塊進行檢測[32]。魚類的研究通常使用激發光λex=290、340、380、410nm激發后的熒光發射光譜進行分析辨別[66-68]。同肉類相似，魚肉的成分復雜，內源性熒光化合物較多，在進行魚肉的新鮮度判別和質量評估時，需要結合常規的理化指標進行分析。物理化學指標主要由AOAC方法直接進行成分分析測定[69]和FFFS結合TVB-N含量（mg/100g）[70]對鱈魚肉進行質量評估[71]?；谇氨砻鏌晒鈴姸葘︳~肉進行分析，一般以色氨酸和NADH熒光信號作為測量指標并結合物理化學指標進行綜合研究。

3.5乳制品類基于UPLC-Q-ExactiveOrbitrapMass對山羊奶、牛奶和豆奶的脂質組分的分析研究中，脂質的含量和分布具有顯著性差異[72]，但乳類中脂質熒光貢獻率一般較低。在乳制品中，熒光貢獻率占主導地位的是核黃素、氨基酸、NADH和FADH。牛乳是乳制品中常見的研究對象，蛋白質含量高，包括色氨酸（λex=230nm，λem=350nm）、酪氨酸（λex=280nm，λem=345nm）、NADH（λex=370nm，λem=520nm）和FADH（λex=450nm，λem=525nm），故蛋白質為研究牛乳的研究對象之一[73]。乳類的成分相對肉類簡單，自體熒光物質、熒光信號相互獨立且明顯，能夠高效地辨別乳類中摻加的抗生素等外源物質、研究磷鈣酸鹽等物質對牛乳的影響[73-74]、研究加熱過程中的視黃醇的變化[75]，以及山羊乳和牛乳的摻假[76]等。乳類食品的研究方向多而且較為深入，一般以維生素和氨基酸以及NADH和FADH作為研究對象，來探究乳制品的摻假[77-78]以及外源條件對乳制品的影響[79-80]等。FFFS還可以對乳制品中的物質進行定量[81]。由于乳制品的特性，一般將牛乳作為熒光的基本研究樣品。

3.6谷物類不同種類的谷物所表現出來的熒光特征峰的種類和強度各不相同。谷物產品的鑒別如：小麥、玉米、黑麥、大米、燕麥、大麥和蕎麥等[82]通常將谷物樣品研磨成粉末狀，通過前表面熒光技術對樣品粉末進行掃描，得到各類樣品的三維熒光圖譜，結合化學計量學分析熒光數據之間的差異則可以對樣品進行初步的判別分析。LeaLenhardt等[83]對谷類粉末的內在熒光進行了深入的研究，在λex=255~305nm，λem=300~410nm和λex=310~400nm，λem=380~490nm之間發現了四種主要的熒光峰，并確認其中一個被分配到氨基酸，另三個被分配到維生素E、維生素B6、4-氨基苯甲酸，故研究谷物一般利用氨基酸、維生素E、維生素B6和4-氨基苯甲酸等熒光物質，谷物類的食物也與烘焙食品相關，研究的物質一般以研究蛋白質、核黃素和NADH為主[84-85]。

3.7面包糕點類面包一般以小麥、黑麥為主要原料，加入水、鹽、酵母揉制成型，經烘、烤、蒸、炸而成。面包在制作過程中往往添加了雞蛋和牛奶，蛋糕則在其基礎上添加了植物奶油。FFFS對面包糕點類產品的檢測一般研究烘焙過程中物質隨時間變化[84-85]以及在儲藏過程中的變化。在λem=305-490nm和λex252-390nm，熒光光譜顯示蛋糕隨著儲存時間和配方中使用的油的類型不同而發生的變化，通過色氨酸和脂質來研究蛋糕使用的油的類型與儲藏時間的關系[86]。利用在λem=510nm處的熒光特征、蛋糕在存儲過程中脂質老化的特點和茴香胺值評估蛋糕的新鮮度的相關系數達到0.73[37]，可以初步評估蛋糕的烘焙過程中物質隨時間而發生的變化。

3.8水果類在研究水果的過程中，通常利用水果中的色素、多酚以及水果中的特殊成分如總黃酮等熒光貢獻率大的物質對其進行分析。在FFFS對蘋果汁的研究中，用多元線性回歸（MLR）和偏最小二乘回歸（PLS）分析證實了熒光預測總黃酮含量（TFC）比總酚含量（TPC）和總抗氧化能力（TAC）更為具有代表性[87]。葡萄的成熟度可以利用葡萄在轉色期時葡萄皮中的花青素的熒光特征結合總可溶性固形物回歸模型（TSS）和總酸度、錦葵色素-3G、總花色苷酚在可見光和熒光光譜的含量來共同表征[39]。利用多酚含量的不同，可以對巴氏蘋果汁、鮮榨蘋果汁和濃縮蘋果漿的品質進行研究，建立模型對蘋果汁進行質量評估模型[42]。故在研究水果的過程中可以天然色素作為FFFS的指標，但多數研究仍然使用總黃酮含量（TFC）和總酚含量（TPC）作為指標。

4．展望

FFFS在食品質量分析中主要應用于非澄清透明液體類食品和固體食品，僅取用待檢測物的少許試樣即可對待測物進行檢測和篩查，具有應用范圍廣（適合多種食品類型）、快速、無損、靈敏度高、特異性強等特點，適用于對大量樣品的現場抽樣篩查，必要時結合儀器分析方法進行結果確證，此策略檢驗效率高、經濟，有效節省大量的人力和物力。目前FFFS的發展趨勢總結如下：熒光作為分子發射光譜容易受到溫度的影響，故溫控前表面熒光裝置的開發將會進一步提高FFFS的分析精度；開發FFFS專用的液體和固體專用樣品支架增強測試的易操性和重復性；熒光儀器的小型化，有利于實現農產品品質的現場檢測；基于智能手機的熒光信號采集裝置的開發也是今后的發展趨勢之一；基于云端的數據模型分析與處理，有利于FFFS的普及與應用。

作者：黃海峰 陳秀珊 劉鳳銀 王宇 劉佳 梁岳 阮媚 高向陽 穆洪濤 單位：廣東第二師范學院生物與食品工程學院