色譜分析法在生物科學(xué)研究中的實(shí)踐范文

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1氨基酸分析

1．1液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀聯(lián)接起來使用，即把色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜的強(qiáng)定性能力結(jié)合起來，在氨基酸分析中得到了廣泛的應(yīng)用。與一般的液相色譜法相比，液—質(zhì)聯(lián)用技術(shù)不但可分離各種氨基酸，而且可以對(duì)未知的氨基酸成分進(jìn)行鑒定;由于使用質(zhì)譜儀作為檢測(cè)部件，還可以不用對(duì)樣品進(jìn)行衍生。王萍等采用高效液相色譜—電噴霧質(zhì)譜法鑒定出了青稞幼苗提取物中的13種氨基酸，證明是一種理想的全譜氨基酸分析方法。Maoetal也利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定了生物樣品中6種硒代氨基酸。此外，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在氨基酸分析中的應(yīng)用也受到了關(guān)注。湯新星等基于高效液相色譜—電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜及固相萃取技術(shù)，建立了分析大鼠血漿中氨基酸的方法，為篩選新的急性輻射損傷標(biāo)記物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1．2氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)氨基酸也可通過氣相色譜法進(jìn)行分離，但氨基酸沸點(diǎn)高，必須通過衍生化處理成為低沸點(diǎn)、易氣化的化合物，再利用試樣中各組分在兩相間的分配系數(shù)不同進(jìn)行分析。目前最常用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)氨基酸進(jìn)行檢測(cè)。王建等利用鹽酸把菌體蛋白水解成氨基酸，再通過分離、濃縮、真空干燥、N-(叔丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺衍生化后得到的衍生物進(jìn)行氣相色譜分離和質(zhì)譜法檢測(cè)，獲得了15種菌體蛋白氨基酸的13C標(biāo)記豐度信息。李長田等采用氣相色譜—質(zhì)譜法測(cè)定了松茸子實(shí)體和液體發(fā)酵菌絲體氨基酸等物質(zhì)，結(jié)果表明，松茸子實(shí)體和發(fā)酵菌絲體二者氨基酸的種類相同，但發(fā)酵菌絲體中某些氨基酸的含量高于子實(shí)體中的含量。Mudiametal則首次應(yīng)用固相微萃取—?dú)赓|(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定了尿液和毛發(fā)中的20種氨基酸，在分離前采用氯代甲酸乙酯對(duì)氨基酸進(jìn)行柱前衍生化處理，該方法靈敏、快速。

1．3超高效液相色譜技術(shù)超高效液相色譜技術(shù)是色譜分析技術(shù)的最新發(fā)展成果之一，與常規(guī)高效液相色譜相比，最主要的差別是采用了超微細(xì)度的固定相顆粒，因而單位柱長的柱效大大提高，實(shí)際使用中就可用更短的色譜柱達(dá)到常規(guī)色譜柱的分離效果，使得整個(gè)分析時(shí)間大大縮短。該技術(shù)已應(yīng)用于許多樣品中氨基酸成分的分析［1，15，19］。孫言春等利用超高效液相色譜法測(cè)定了史氏鱘、達(dá)氏鰉和小體鱘卵中17種氨基酸的含量，完成一次分析僅需10min。超高效液相色譜法還被應(yīng)用于快速分析和鑒定3種生菜中的氨基酸，并發(fā)現(xiàn)了10種由已知氨基酸和倍半萜內(nèi)酯所形成的新結(jié)構(gòu)單元，為生菜等植物所具有的潛在生物活性找到科學(xué)依據(jù)。

2蛋白質(zhì)分析

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，幾乎參與生命活動(dòng)的每一環(huán)節(jié)，在機(jī)體的生長、發(fā)育、代謝、衰老等過程中發(fā)揮重要作用。但蛋白質(zhì)種類很多，在分子量大小、帶電性、分子結(jié)構(gòu)和生物特異性等方面均有很大差異。因此在分離模式、定量和定性方法上都有很大差別。根據(jù)分離原理的不同，用于蛋白質(zhì)測(cè)定的液相色譜法主要可分為反相色譜法、排阻色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、疏水相互作用色譜法和逆流色譜法等。此外，還包括基于色譜分離技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)等發(fā)展而來的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、多維液相色譜法和超高效液相色譜法等。目前用于生物樣品中蛋白質(zhì)檢測(cè)的主要方法及其典型應(yīng)用見表2。

2．1反相色譜法反相色譜法主要利用被測(cè)組分對(duì)極性流動(dòng)相和非極性固定相的作用力不同加以分離。這種分離系統(tǒng)在液相色譜分離模式中使用最為廣泛。對(duì)于生物大分子、蛋白質(zhì)及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關(guān)注。Silvaetal采用反相色譜—質(zhì)譜技術(shù)分離測(cè)定了人血清中的11種常規(guī)蛋白的濃度;王娟等采用AgilentZorbax300SB-C8色譜柱，建立了測(cè)定牛奶中主要蛋白質(zhì)(4種酪蛋白與乳清蛋白)的反相高效液相色譜法，在波長214nm處對(duì)分離后的蛋白質(zhì)進(jìn)行紫外檢測(cè)。于海洋等則用納升級(jí)反相液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)分析了錦燈籠果實(shí)提取物中蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，鑒定得到60種蛋白質(zhì)，其中與抗氧化相關(guān)的蛋白質(zhì)有3種。

2．2排阻色譜法排阻色譜法是根據(jù)被測(cè)組分在固定相中的滲透能力不同而分離的。這種色譜法采用多孔性凝膠為固定相，較小的分子較易被保留，因而是依照分子量的大小順序出峰。生物體中各種蛋白質(zhì)分子量常常差異很大，很適合用排阻色譜法進(jìn)行分離。利用排阻色譜法將溶液中的蛋白質(zhì)按照分子量大小進(jìn)行分離，再配合特征波長的紫外檢測(cè)器，可有效地將目的蛋白捕獲并測(cè)定。Bondetal借助排阻色譜技術(shù)，并配合雙波長紫外檢測(cè)，研究了在不同環(huán)境條件下IgG1單克隆抗體的含量水平及聚合降解等特性。重組人白介素-1受體拮抗劑蛋白的測(cè)定也可采用這種方法，在0．018－2．4mg•mL－1范圍內(nèi)，該方法的線性關(guān)系良好，回收率為99．1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1．09%。

2．3離子交換色譜法離子交換色譜法主要是利用蛋白質(zhì)在pH值高于或低于等電點(diǎn)時(shí)可分別帶負(fù)電荷和正電荷的特點(diǎn)而進(jìn)行分離。不同蛋白質(zhì)組分離子對(duì)作為固定相的離子交換劑的交換能力不同，保留時(shí)間也不同。在大孔硅膠表面通過聚合鍵入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨制得的強(qiáng)陰離子交換色譜填料，可用于雞蛋中卵清蛋白的分離純化，所需時(shí)間在20min之內(nèi)。隋少卉等則用強(qiáng)陽離子交換色譜分離了肝癌細(xì)胞中磷酸化蛋白，并與等電聚焦技術(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，在分離效果方面前者優(yōu)于后者，但在定量分析的穩(wěn)定性方面，后者則優(yōu)于前者。在多維色譜分離系統(tǒng)中，離子交換色譜常被作為第一維，以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)混合物的預(yù)分離。

2．4液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)蛋白質(zhì)在紫外區(qū)有吸收，因此在分離之后可以不經(jīng)衍生直接用紫外檢測(cè)器測(cè)定，但紫外檢測(cè)器對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定能力差。液質(zhì)聯(lián)用法兼具強(qiáng)分離和強(qiáng)定性能力，而且靈敏度高，更適合于復(fù)雜蛋白質(zhì)的分析。各種類型的色譜分析法都可與質(zhì)譜法聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的高效分析。這種色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已用于毛白楊次生維管系統(tǒng)蛋白、人體腸組織運(yùn)輸?shù)鞍缀途铙w蛋白等的分析測(cè)定。

2．5多維高效液相色譜法多維高效液相色譜法是利用兩根或多根性質(zhì)不同的色譜柱，通過一定的接口和切換技術(shù)進(jìn)行不同色譜分離模式的組合，完成對(duì)復(fù)雜樣品中待分析組分的分離。與一維液相色譜相比，多維液相分離系統(tǒng)具有更高的峰容量和分離能力，因而已在蛋白質(zhì)分析和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到越來越多的應(yīng)用。其中，離子交換色譜—反相高效液相色譜是最常用的分離系統(tǒng)。血漿中高豐度蛋白質(zhì)的存在嚴(yán)重干擾低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)，利用強(qiáng)陰離子交換色譜—反相高效液相色譜二維液相色譜技術(shù)，可使血漿蛋白質(zhì)得到充分分離，再借助串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)血漿中的高豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行色譜定位并去除。

2．6超高效液相色譜技術(shù)超高效液相色譜技術(shù)已用于大鼠肝組織、人體膜組織蛋白及奶粉等生物樣品中蛋白質(zhì)的快速檢測(cè)。Jietal建立了超高效液相色譜—多反應(yīng)監(jiān)測(cè)串聯(lián)質(zhì)譜法，可同時(shí)測(cè)定3種人細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)鞍祝€性范圍為0．2－20μg•mL－1，精密度和準(zhǔn)確度均可控制在15%以下，為膜蛋白在人體內(nèi)外表達(dá)的研究提供幫助。Zhangetal把超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉和乳清蛋白濃縮物中牛乳清蛋白含量的測(cè)定，該方法的回收率、重現(xiàn)性和檢出限均符合實(shí)際樣品測(cè)定的要求。

3小結(jié)

綜上所述，色譜分析技術(shù)可應(yīng)用于不同生物樣品中各種氨基酸和蛋白質(zhì)的含量分析和組成鑒定。色譜分析技術(shù)已從較簡單的氣相色譜和液相色譜技術(shù)，發(fā)展到色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，再到多維色譜技術(shù)和超高效液相色譜技術(shù)等等。隨著科技的進(jìn)步和生物科學(xué)研究的不斷深入，將會(huì)有更多符合實(shí)際需要的新色譜技術(shù)出現(xiàn)，可為氨基酸和蛋白質(zhì)的分析尋找到更加理想的分離檢測(cè)模式。

作者：張舒歡周碧青單位：福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院福建農(nóng)林大學(xué)測(cè)試中心