化學品皮膚刺激性實驗的評估范文

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1方法

該皮膚模型的所有生物性成分及其培養環境均經過病毒、細菌和支原體的測試。皮膚模型最終產品都要經過MTT＆SDS細胞毒素測試和生物組織檢查。基于質量控制的指標，“EpiSkin”表皮模型的IC50值均大于或等于1mg/ml，可用于正式皮膚刺激性測試。用HematoxylinEosinSaffron染色來評價表皮模型是否良好分化。該皮膚模型評分均高于或等于18.0，表明表皮模型的表皮分化良好，具備基底層、網狀層、顆粒層和較厚的角質層，允許用于刺激性測試。

對于每一種化學品，需要3輪不同批次的皮膚模型來對其進行皮膚刺激性的測試。參照OECD439歐盟標準測試方法，具體步驟如下:(1)化學品10μl(固體10mg研成粉末，同時加蒸餾水5μl)局部接觸面積約0.38cm2的皮膚模型表面15min。(2)陰性對照加10μlPBS、陽性對照加10μl5%SDS。(3)與化學品接觸15min后用25mlPBS沖洗活性皮膚，浸入2.0ml維持培養基內。1～3步需在通風安全柜中進行。(4)繼續在飽和濕度、5%CO2、37℃的條件下孵育42h。(5)浸入2.0ml濃度0.3mg/ml的MTT溶液(用測試培養基配制)內，在飽和濕度、5%CO2、37℃孵育3h。(6)MTT反應完的皮膚模型，浸入500μl酸化異丙醇的錐形底離心管內，用振蕩混合儀混勻，在室溫、避光的條件下過夜。(7)振蕩混合儀混勻每個離心管，每管中取200μl標本加入96孔板微量比色池中，在570nm用酶標儀讀取A值，以酸化異丙醇溶液作為空白對照。將本實驗結果按照下列公式，將所得A值換算為細胞相對活力值，用細胞相對活力值來判斷化學品是否具有刺激性，陰性對照的平均A值相當于100%的細胞活力(計算細胞相對活力值方法參照OECD439)。相對細胞活力百分比(%)=100×(某化學物的A值/陰性對照的平均A值)。求取3輪測試的相對細胞活力值的平均值，得到該化學品的細胞相對活力值。評判化學品刺激性的標準:細胞相對活力＜50%判斷為有刺激性(I)，≥50%為無刺激性(NI)。

2結果

20種化學品的相對細胞活力百分比見表1。根據本研究實驗結果，對所測試的20種化學品與歐洲替代方法驗證中心(ECVAM)的化學品分類標準(這20種化學品分類標準是依據兔皮膚實驗體內測試)測試結果進行比較，同時也與歐盟認可皮膚模型EpiSkin在歐洲的體外測試結果比較，結果見表2。在20種化學品中，ECVAM體內測試分類數據表明刺激性化學品為10種，本實驗皮膚模型能正確分類9種;非刺激性化學品為10種，能正確分類7種。將本研究的結果數據與ECVAM體內測試結果進行比較，“EpiSkin”皮膚模型的靈敏度為90%，特異性為70%，刺激性結果預測率90%，非刺激性結果預測率70%;準確率達到80%。其靈敏度與特異性均達到歐盟經濟合作與發展組織OECD認可的要求，即靈敏性70%，特異性90%。此皮膚模型有望作為評價化學品皮膚刺激性的替代方法。

3討論

動物實驗在研究疾病、開發檢測醫藥和疫苗、評價化學物質的危險性等諸多方面，有著不可或缺的重要作用。但動物實驗也有實驗周期長、耗時費力、動物間存在個體差異等缺點。隨著各國有關動物福利法律的完善，尋找替代動物實驗的科學方法得到了各國政府和科學工作者的關注。許多發達國家廣泛開展了體外替代方法的研究和驗證工作，已涉及到皮膚刺激和腐蝕性實驗、眼刺激和腐蝕性實驗、光毒性實驗、皮膚致敏性實驗以及熱原檢驗等。EpiDerm(MatTekCorpor-ation，Ashland，MA，USA)和EpiSkin(EPISKINSNC，Lyon，France)已被正式授權在歐盟范圍內成為皮膚腐蝕性與刺激性檢測的工具。

本研究采用3D人工皮膚模型“EpiSkin”采用MTT方法定量細胞活力，以相對細胞活力值為標準，與ECVAM體內測試分類結果相比較，能正確判定所選10種刺激性化學品中的9種，靈敏度達到90%;能正確判定10種非刺激性化合物中的7種，該皮膚模型特異性為70%。和被歐盟認可的EpiSkin皮膚模型在歐洲的評價結果相一致。因此，本實驗的測試方法的預測能力完全符合OECD439的要求。根據本研究結果得出3D人工皮膚模型“EpiSkin”可以評估化學品的皮膚刺激性。

作者：馬丹趙曉娟付溥博張西萌魏海燕劉莉曾靜單位：北京出入境檢驗檢疫局