圖書館室內空間布局范文

本站小編為你精心準備了圖書館室內空間布局參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

［摘要］目的摘要：在外源抗原表位表達載體系統(tǒng)中構建并表達乙型肝炎病毒(HBV)抗原表位，并對其診斷敏感性進行評價。方法摘要：人工合成編碼HBV“a”抗原決定簇表位中24個氨基酸(S124147)的寡核苷酸序列，克隆入外源抗原表位表達載體系統(tǒng)FHVRNA2I3位點，構建重組質粒，在原核pET系統(tǒng)(BL21細胞)中表達。通過ELISA和Westernblot檢測表達產物的抗原性，并以表達產物為包被抗原,通過ELISA和Westernblot檢測58份乙肝患者血清抗HBs。結果摘要：嵌和蛋白可和抗HBs特異性結合，其ELISA檢測抗HBs陽性率為77.5%，Westernblot的為68%，而對照試劑盒的為62%。結論摘要：在外源抗原表位表達系統(tǒng)中表達的HBV重組抗原表位具有良好的抗原性，有診斷應用價值。

［］HBV;抗原表位;抗原性;FHVRNA2載體系統(tǒng)

乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的病原體，并引起慢性肝炎和肝硬化，而且和肝癌的發(fā)生密切相關。迄今，對HBV感染最有力的預防和控制辦法，仍是發(fā)展疫苗。FHVRNA2載體系統(tǒng)［1］是一個以昆蟲小RNA病毒flockhousevirus外殼蛋白為載體的新型抗原表位表達載體，此系統(tǒng)中表達的載體蛋白可自動組裝成病毒樣顆粒，使插入的外源抗原表位可以暴露在顆粒的表面，保持天然構象和免疫學特性。本探究擬將HBVa抗原表位插入到FHV外殼蛋白上，并對其抗原性及診斷意義進行了探究。

1材料和方法

1.1細胞重組質粒DNA大腸桿菌DH5α用于重組質粒pETEDNA的克隆和擴增。大腸桿菌BL21(DE3)用于重組質粒pETEDNA的表達。質粒DNA在含200μg/ml氨芐青霉素的LB或TB培育中生長，F(xiàn)HVRNA2載體系統(tǒng)即重組pETFHV構建見［1］。

1.2HBV抗原表位及重組pETE的構建和表達

1.2.1HBV抗原表位及重組pETE的構建人工合成HBV特異抗原表位E(氨基酸序列摘要：124CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC147)寡核苷酸序列摘要：正向5’GATGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGC3’；反向3’CTACGTGCTGAGGACGAGTTCCGTTGAGATACAAAGGGAGTACAACGACATGTTTTGGATGCCTACCTTTAACG5’，兩端為Bsu36I識別位點，和經Bsu36I功能后的重組pETFHVDNA混勻后置室溫連接2h,轉化DH5α細胞，接種LB平板(200μg/mlAmp)培養(yǎng)。重組質粒pETEDNA經酶切篩選并經DNA序列測定。

1.2.2攜帶HBV抗原表位的嵌和蛋白的表達重組pET系統(tǒng)中，嵌和蛋白的表達受T7啟動子的控制［2］。BL21經重組pETEDNA轉化后，在TB培養(yǎng)液中37℃生長16h～18h,細胞經4000r/10min離心沉淀,用超聲裂解緩沖液懸浮，超聲裂解，裂解液經離心，棄上清，沉淀(包涵體)用8mol/L尿素溶解。

1.2.3SDSPAGE及Westernblot分析方法見前文［1，3］，3，3二氨基苯胺四氫鹽酸(DAB)底物試劑為AMRESCO公司產品;第二抗體辣根過氧化物酶(HRP)結合物購自華美公司。

1.3HBV重組抗原表位診斷意義評價

1.3.1ELISA檢測血清樣本固相ELISA檢測如前文所述［1］，以純化的嵌和蛋白為包被抗原，每孔100μl(含1μg純化嵌和蛋白)，檢測58份乙肝患者血清中抗HBs，和抗HBsELISA檢測試劑檢測結果比較。陽性判定標準為(檢測血清A492底物對照A值)/(陰性血清A492底物對照A值)%26gt;2.1。鄰苯二胺二氫鹽酸(OPD)購自AMRESCO公司；第二抗體辣根過氧化物酶(HRP)結合物購自華美公司；乙肝患者血清由昆明市傳染病醫(yī)院收集;抗HBsELISA檢測試劑盒購自上海科華公司。

1.3.2HBV重組抗原表位Westernblot檢測血清樣本方法見前文［3］，檢測了58份乙肝患者血清樣本。

2結果

2.1攜帶HBV抗原表位的嵌和蛋白的表達FHVRNA2cDNA載體系統(tǒng)即重組pETFHV構建見文獻［4］，其編碼產物是FHV外殼蛋白，三維立體結構已得到精確測定，其上有6個可供外源抗原表位插入的位點［5］(見圖1)。應用該系統(tǒng)，我們將人工合成HBV抗原表位寡核苷酸序列插入到重組pETFHVDNA上，構建攜帶HBV抗原表位的重組質粒pETE，經NsiⅠ和NcoⅠ雙酶切篩選(見圖2)和DNA序列測定無誤后轉化BL21細胞，高水平表達嵌和蛋白。經SDSPAGE和考馬斯亮藍染色(見圖3)和Westernblot(見圖4)分析結果表明，這些嵌和蛋白為攜帶有HBV抗原表位的重組FHV外殼蛋白。

圖1FHV外殼蛋白的三維結構摘要：示可供選擇的外源抗原表位序列插入位點L1、L2、L3、I1、I2，I3HBV抗原表位氨基酸序列在FHV中插入位點。（略）

圖2重組質粒NcoⅠ+NsiⅠ酶切圖（略）

2.2攜帶HBV重組抗原表位的嵌和蛋白在BL21中的表達和鑒定攜帶HBV抗原表位的重組質粒pETFHVE在BL21(DE3)轉化細胞中高水平表達了攜帶HBV抗原表位的嵌合蛋白FHVE,其分子質量和陽性對照相同，約為45000(等于載體FHV外殼蛋白的分子質量43000加上HBV抗原表位的分子質量)。經SDSPAGE和考馬斯亮藍染色(見圖3)及Westernblot(見圖4)分析結果表明，重組抗原表位顯示了抗原性。

圖3攜帶HBVa特異抗原表位的嵌合蛋白SDSPAGE(10%)分析（略）

圖4嵌合蛋白的Westernblot分析（略）

2.3HBV重組抗原表位ELISA檢測敏感性分析我們用嵌和蛋白為包被抗原用間接ELISA法檢測58份乙肝患者血清中抗HBs抗體，檢測陽性率為77.5%，高于ELISA試劑盒檢測的62%。

2.4HBV重組抗原表位Westernblot以嵌和蛋白為包被抗原用Westernblot檢測58份乙肝患者血清中抗HBs抗體，檢出陽性率為68%。

3討論

3.1HBVa抗原表位在疫苗及診斷應用探究中的意義根據(jù)HBsAgS蛋白的抗原性不同，將HBV分為9個血清型(即HBsAg亞型)［6，7］摘要：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-、adrq+。HBVS蛋白第120～第160氨基酸序列是HBV的交叉中和抗原表位即a表位［8］，可誘導產生交叉中和抗體，保護成人免受各HBV亞型的感染。本探究進一步表明，HBVa重組抗原表位可和臨床不同來源的血清抗HBs發(fā)生特異性結合，具有疫苗探究和診斷意義。

3.2新型抗原表位表達載體系統(tǒng)對于抗原表位來說，決定其免疫原性和抗原性的因素除了氨基酸序列，更重要的是分子的空間構象和呈遞給免疫細胞識別的方式。利用FHVRNA2表達載體在大腸桿菌中表達的抗原表位具有良好的免疫原性，免疫小鼠產生了交叉中和抗體［9］，并已成功的在該系統(tǒng)中表達了HIV1V3、輪狀病毒Vp4抗原表位和HCV抗原表位，并誘導中和抗體和交叉中和體產生［1，10，11］。HBV抗原表位在FHVRNA2載體系統(tǒng)可中高效地表達，并近似天然構象，能被天然抗HBs抗體特異性識別結合，具有良好的抗原性，在以其為包被抗原用ELISA和Weternblot檢測抗HBs中檢測敏感性和ELISA診斷試劑盒差異無顯著性，在HBV診斷試劑和重組抗原表位亞單位疫苗探究中具有重要意義。