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隨著抗真菌藥的臨床應(yīng)用，耐藥菌株逐漸產(chǎn)生。近年來(lái)有關(guān)對(duì)真菌藥物耐受的念珠菌報(bào)道增多，已引起醫(yī)學(xué)界和藥學(xué)界廣泛關(guān)注，許多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了深入探討和研究。
一、念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥現(xiàn)象
（一）耐藥菌株的增多與傳播：HIV感染、器官移植、惡性腫瘤患者，由于免疫功能低下或抑制，易伴發(fā)條件致病性感染特別是真菌感染，%～80%艾滋病患者有一種或幾種真菌感染。唑類(lèi)藥物廣泛用于臨床治療和預(yù)防，由于長(zhǎng)期反復(fù)和大劑量應(yīng)用，耐藥菌株和發(fā)生率日趨升高。據(jù)報(bào)道法國(guó)Pasteur醫(yī)院和其它幾個(gè)研究中心1994年分離自艾滋病患者的念珠菌株10%對(duì)氟康唑耐藥[1]。而新近的統(tǒng)計(jì)資料顯示，在艾滋病患者口咽感染念珠菌中，33％以上是耐藥菌株，對(duì)氟康唑的最小抑菌濃度（MIC）＞12.5μg/ml（敏感菌株MIC值一般＜4μg/ml）[2]。
Dromer等報(bào)道在10對(duì)已保持性關(guān)系專(zhuān)一并穩(wěn)定1年以上的HIV陽(yáng)性伴念珠菌感染的患者中，有13例口咽分離的感染菌株對(duì)氟康唑耐藥。從未用過(guò)唑類(lèi)藥物的5例患者，其性伴感染的念珠菌株卻均對(duì)氟康唑有耐藥性。進(jìn)一步通過(guò)DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析（RFLP）發(fā)現(xiàn)，這些感染菌株具有很近的種系關(guān)系，上述10對(duì)性伴中有6對(duì)的分離菌具有一個(gè)以上的相同克隆片段，因此可認(rèn)為耐藥菌株可以通過(guò)性伴傳播[3]。
（二）耐藥菌株對(duì)唑類(lèi)藥物具有交叉耐藥性：HexiaoGang對(duì)分離自HIV感染者的212株白念珠菌（以下簡(jiǎn)稱白念）研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)菌株對(duì)氟康唑敏感，MIC值＜2μg/ml,這些菌株對(duì)伊曲康唑的MIC50及MIC90值也相應(yīng)較低,范圍在0.05μg～0.1μg/ml之間。另有61株對(duì)氟康唑敏感性較差，其MIC值為4μg～62μg/ml,MIC50及MIC90值分別是8μg/ml、64μg/ml；同時(shí)測(cè)得伊曲康唑?qū)@些菌株的MIC50和MIC90值分別是0.2μg/ml和0.4μg/ml。由此可見(jiàn)，這些菌株不但對(duì)氟康唑不敏感，對(duì)伊曲康唑的MIC50和MIC90值也相應(yīng)增高了約4倍。盡管臨床上尚未證實(shí)唑類(lèi)藥物間的交叉耐藥性，但這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果顯示了氟康唑與伊曲康唑間的交叉耐藥現(xiàn)象[4]。另有研究結(jié)果也支持這一論點(diǎn)，并進(jìn)一步指出靶酶編碼基因和膜上轉(zhuǎn)運(yùn)泵編碼基因的突變、缺失和過(guò)分表達(dá)是交叉耐藥產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。
（三）耐藥現(xiàn)象導(dǎo)致了感染菌種的變遷：Price等對(duì)美國(guó)一家醫(yī)院1987至1992年5年間分離的念珠菌進(jìn)行氟康唑體外敏感試驗(yàn)，并對(duì)血標(biāo)本中菌種的分布進(jìn)行了氟康唑使用前后對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)MIC值具有明顯的種間差異，白念對(duì)氟康唑最敏感，而光滑念珠菌敏感性最差。這一結(jié)果與5年間菌血癥致病菌種的變遷相一致。在氟康唑使用前和使用初期，白念感染率為87%，但到1992年（氟康唑已廣泛應(yīng)用）只占感染菌株的31%。在此期間，光滑念珠菌的感染率由2%升到26%；熱帶念珠菌從2%升到24%；克柔念珠菌從9%升到20%。由此可見(jiàn)，隨著氟康唑廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致了念珠菌菌血癥致病菌向非白念的變遷[6]。然而并非所有學(xué)者認(rèn)為臨床治療可導(dǎo)致酵母感染菌種變遷。Sobel在10余年的臨床實(shí)踐中，對(duì)許多念珠菌性陰道炎患者盡管長(zhǎng)期給予酮康唑治療，但并未發(fā)現(xiàn)引起陰道炎的酵母菌種發(fā)生改變[7]。
二、念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥的相關(guān)因素
（一）細(xì)胞免疫低下或缺陷易導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生：對(duì)伴口咽念珠菌感染的HIV患者研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞免疫降低者對(duì)念珠菌有易感性，同時(shí)在這些患者身上也易發(fā)生耐藥現(xiàn)象。在臨床治療失敗的病例中，測(cè)其MIC值明顯升高，且在CD4細(xì)胞數(shù)＜20μl患者身上耐藥顯著高發(fā)，提示耐藥的產(chǎn)生除與氟康唑的長(zhǎng)期應(yīng)用有關(guān)外，CD4細(xì)胞數(shù)減少更易產(chǎn)生耐藥菌株[8]。Redding觀察1例反復(fù)發(fā)生口咽念株菌感染的患者，在2年反復(fù)14次治療中，氟康唑有效量由100mg/d快速升至800mg/d，MIC值亦由0.25μg/ml上升到＞64μg/ml。其間測(cè)得患者CD4細(xì)胞數(shù)是9/μl。在第15次再次發(fā)病時(shí)，氟康唑800mg/d已經(jīng)無(wú)效[9]。有學(xué)者推斷，免疫系統(tǒng)嚴(yán)重缺陷可能阻止抗真菌藥物效應(yīng)的正常發(fā)揮。
（二）藥物與機(jī)體感染狀況對(duì)念珠菌耐藥有誘導(dǎo)作用：Vuffray等對(duì)口服氟康唑150mg/d已耐藥的口咽念珠菌感染的HIV患者改用更高劑量，其中91例次治療失敗者既往用藥的平均累積量是100mg,而119例次治療有效的平均累積量是4400mg。兩者用藥累積量有顯著性差異（P＜0.001）。提示藥物的應(yīng)用與菌株耐藥的產(chǎn)生密切相關(guān)[10]。Cameron等隨機(jī)選擇87例HIV陽(yáng)性患者分組研究，對(duì)其中22例有口咽或食管感染癥狀和17例無(wú)癥狀的白念分離菌株進(jìn)行唑類(lèi)藥敏感試驗(yàn)（兩組患者均有唑類(lèi)藥應(yīng)用史），兩組MIC值有非常顯著性差異（P＜0.0001）；前者高于后者。接著又對(duì)分別來(lái)自未經(jīng)唑類(lèi)藥治療的無(wú)癥狀和有癥狀患者的分離菌株進(jìn)行MIC值對(duì)比分析，其P值＜0.0001，有癥狀者顯著高于無(wú)癥狀者。以上研究結(jié)果顯示藥物應(yīng)用史和感染癥狀與唑類(lèi)藥物對(duì)其致病菌株的MIC值升高顯著相關(guān)。作者又對(duì)其余非白念菌株進(jìn)行上述對(duì)比研究，結(jié)論相同[11]。
（三）菌株的耐藥性可能經(jīng)遺傳獲得：挪威學(xué)者對(duì)13株挪威念珠菌進(jìn)行氟康唑藥敏試驗(yàn)，其中11株分離自1990至1996年門(mén)診就醫(yī)的8例惡性病患者，其中僅2例有氟康唑治療史，另2株為年前的保藏菌。結(jié)果對(duì)所有菌株MIC值均＞32μg/ml。年前的保藏菌株和未經(jīng)治療者的致病菌株亦出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，提示耐藥并非均為唑類(lèi)藥物應(yīng)用所誘導(dǎo)，菌株的耐藥性很可能具有遺傳性[12]。有研究推測(cè)這些耐藥表型至少可以穩(wěn)定0代[13]。
因而，患者最初感染的可能即為具有遺傳穩(wěn)定性的耐藥菌株，也可能在長(zhǎng)期唑類(lèi)藥臨床應(yīng)用中由敏感菌株突變成為耐藥菌株。耐藥的產(chǎn)生與許多已知和未知的因素有關(guān)，但藥物的長(zhǎng)期反復(fù)治療和預(yù)防應(yīng)用起著關(guān)鍵作用。因此有學(xué)者指出應(yīng)最大限度地避免上述用藥方式。并提出兩條防止和延緩耐藥產(chǎn)生的措施：①短期大劑量用藥以盡快有效地殺滅真菌，降低耐藥突變的發(fā)生率。②對(duì)于唑類(lèi)耐藥的菌株，除了加大劑量外，適時(shí)換用其它藥物也是非常必要的[14]。
三、念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥機(jī)理
迄今為止，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為念珠菌對(duì)唑類(lèi)藥物的耐藥主要通過(guò)以下三條途徑：①細(xì)胞膜對(duì)唑類(lèi)藥物通透性改變，細(xì)胞攝取和蓄積的藥物量降低。②藥物作用的靶酶C-14去甲基化酶（14DM）產(chǎn)生過(guò)多。③靶酶對(duì)藥物的親和力降低。后二條可歸納為唑類(lèi)藥物作用靶酶的改變。通常認(rèn)為，膜通透性的改變起更重要的作用。有學(xué)者對(duì)敏感和耐藥的光滑念珠菌研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)3H標(biāo)記的氟康唑，敏感菌株攝入率是0.33±0.02pmol/min，耐藥菌株幾乎不能顯示熒光攝入。同時(shí)測(cè)兩者IC50（50%inhibitionofincorporation）值相近，IC50反映藥物對(duì)靶酶抑制作用，靶酶改變無(wú)明顯差異。說(shuō)明膜通透性改變?cè)谀退幃a(chǎn)生中起關(guān)鍵作用[15]。
（一）對(duì)靶酶變化的研究：唑類(lèi)藥物作用的靶酸是膜成分麥角固醇合成中不可缺少的中間合成酶，唑類(lèi)藥物對(duì)此具有強(qiáng)的親和性，從而抑制酶的催化活性，麥角固醇合成受阻，胞膜結(jié)構(gòu)破壞，真菌生長(zhǎng)抑制。靶酶結(jié)構(gòu)改變以及其過(guò)度表達(dá)均可導(dǎo)致念珠菌耐藥，許多學(xué)者對(duì)這一耐藥機(jī)理進(jìn)行了研究。
從理論上講，靶酶編碼基因Erg16的擴(kuò)增可致其過(guò)度表達(dá)。Sanglard等人用URA3-14DM雜交基因探針對(duì)分離自5例艾滋病患者的16株白念進(jìn)行DNA分析，結(jié)果無(wú)論耐藥還是敏感菌株，其靶酶基因Erg16的拷貝數(shù)均無(wú)變化。因而推測(cè)靶酶的過(guò)度表達(dá)并非由基因Erg16的擴(kuò)增所致。Sanglard又采用Northernblot方法對(duì)耐藥和敏感菌株靶酶的mRNA含量進(jìn)行測(cè)定。
發(fā)現(xiàn)大部分mRNA含量高的菌株，其MIC值相應(yīng)增高。但有1株靶酶mRNA含量高的菌株，MIC值卻顯著低于另1株mRNA含量低的菌株。因而僅用靶酶mRNA含量升高只能部分地解釋耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生[16]。由靶酶過(guò)分表達(dá)而耐唑類(lèi)藥物的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)有待進(jìn)一步深入探討。
White曾對(duì)17株白念Erg16基因進(jìn)行分析，該基因含有始動(dòng)區(qū)域的5個(gè)片段（PA～PE），編碼區(qū)域的7個(gè)片段和終止區(qū)域的3個(gè)片段（TA～TC）。利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)這些片段擴(kuò)增后行序列分析。與敏感菌株相對(duì)照，耐藥菌株在編碼區(qū)域第7片段近3’端的1547位點(diǎn)發(fā)生堿基突變，鳥(niǎo)嘌呤（G）由腺嘌呤（A）取代，相應(yīng)地Erg16編碼蛋白質(zhì)也發(fā)生改變，位于467位點(diǎn)的精氨酸（Arg）由賴氨酸（Lys）替代。這一位點(diǎn)正處于靶酶的活性中心，它改變了酶的活性，也引起菌株對(duì)唑類(lèi)的耐藥。對(duì)PE片段位點(diǎn)-367至-284序列分析發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株可以有多處等位基因異質(zhì)性（heterogenicity），并在-284位點(diǎn)有等位基因缺失突變。推測(cè)可能與基因重組和基因轉(zhuǎn)換有關(guān)，這些突變基因與菌株對(duì)唑類(lèi)耐藥有關(guān)[17]。
（二）細(xì)胞膜對(duì)唑類(lèi)藥物通透性改變是真菌耐藥的一個(gè)主要因素：有實(shí)驗(yàn)測(cè)知敏感白念菌株胞內(nèi)唑類(lèi)濃度是胞外的2.5倍以上，而耐藥菌株胞內(nèi)僅是胞外的1/2。耐藥菌株膜通透性的改變，主要依賴膜上兩種蛋白泵的功能改變。一種泵是ATP能量依賴型的多藥載體（亦稱ABCtransporters），進(jìn)行能量依賴的主動(dòng)運(yùn)輸；另一種泵簡(jiǎn)稱BEN，通過(guò)電化學(xué)勢(shì)能進(jìn)行被動(dòng)運(yùn)輸，屬于非能量依賴型載體。這兩種與耐藥有關(guān)的載體被劃屬于ABC超家族和MF超家族[16]。這兩種泵將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。研究發(fā)現(xiàn)，膜對(duì)唑類(lèi)通透性降低不是由于藥物攝入的減少，而是由胞內(nèi)泵出藥物的增多，即兩種泵功能的增強(qiáng)與耐藥密切相關(guān)。
有學(xué)者對(duì)這兩種蛋白泵的基因進(jìn)行分析，在分離自5例艾滋病患者的17株白念中，菌株2號(hào)、3號(hào)、16號(hào)、17號(hào)的MIC值較基余菌株有明顯升高。用斑點(diǎn)雜交的方法檢測(cè)兩種蛋白泵基因CDR（編碼ABC蛋白泵）和MDR（編碼BEN蛋白泵）的mRNA水平。結(jié)果CDR的mRNA水平在16和17號(hào)菌株比在1～15號(hào)菌株約增高5倍。MDR的mRNA水平基本呈現(xiàn)隨MIC值而升高的趨勢(shì)，第1株反映mRNA水平的熒光信號(hào)很弱，mRNA水平很低，2號(hào)和3號(hào)菌株熒光信號(hào)大大增強(qiáng)，mRNA水平分別是1號(hào)的12倍和25倍。因此推測(cè)蛋白泵的mRNA水平升高是耐藥的分子生物學(xué)改變[5]。進(jìn)一步分析認(rèn)為轉(zhuǎn)錄水平的升高和mRNA加帽和多聚尾的修飾改變可能是mRNA含量升高的主要原因。也有學(xué)者認(rèn)為一些開(kāi)放閱讀框架（ORFs，編碼氨基酸的三聯(lián)體長(zhǎng)鏈，無(wú)終止密碼子，是基因存在的區(qū)域）可能與ABC和MF兩家族的基因編碼有關(guān)。Alarco的研究結(jié)果顯示對(duì)白念MF家族的編碼基因BEN的啟動(dòng)子AP1的過(guò)分表達(dá)可致菌株耐藥，但開(kāi)放閱讀框架有缺失突變時(shí)該菌株的耐藥性可被大大地抑制或消失。FLR1（Fluconazoleresistance1）的表達(dá)又受AP1蛋白的調(diào)節(jié)，F(xiàn)LR1的表達(dá)可被AP1的過(guò)分表達(dá)所誘導(dǎo)。因而FLR1，這個(gè)編碼MF家族多藥載體的開(kāi)放閱讀框架可能是受AP1蛋白調(diào)控的一種決定菌株耐藥性的分子因素[18]。
上述研究顯示，在菌株產(chǎn)生耐藥過(guò)程中，可能通過(guò)三條耐藥途徑，也可能主要通過(guò)一條途徑。但耐藥機(jī)理的闡明尚需多方面拓寬和深入研究。