肝癌合并糖尿病診斷標志物的研究范文

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【摘要】目的:篩選肝癌合并糖尿病的診斷分子標志，檢測其在肝癌及糖尿病中的表達情況，為早期診斷肝癌合并糖尿病提供相應的分子標志物。方法:通過綜合分析GEO及TCGA數據庫篩選肝癌合并糖尿病的差異性分子，組織芯片上檢測其在正常組織及肝癌組織的表達情況，ELISA檢測其在糖尿病患者血清樣品中的表達情況。收集臨床血液標本，檢測其在正常人、肝癌合并糖尿病、肝癌未合并糖尿病患者中的表達水平。繼而在15例肝癌患者中，分析上述分子標志與血糖的相關性。結果:通過GEO及TCGA數據庫篩選得到肝癌合并糖尿病的差異性基因CXCL14，組織芯片及ELISA結果表明CXCL14在肝癌患者及糖尿病患者中呈低表達。血液中CXCL14在肝癌合并糖尿病患者的表達水平明顯低于肝癌未合并糖尿病組。肝癌患者中CX-CL14表達水平與血糖濃度呈負相關。結論:CXCL14可能與肝癌合并糖尿病的發生發展相關，早期檢測肝癌患者血清中CXCL14的表達水平可能作為糖尿病的一個預測指標。

【關鍵詞】肝癌;糖尿病;CXCL14

WHO統計表明，肝癌在惡性腫瘤發病及死亡原因中排列第三位，每年超過80萬人死亡［1，2］，肝癌仍然是一個日益嚴重的全球健康問題。在中國，肝癌死亡率排列第二位，5年生存率僅為10．1%［3］。肝臟是維持血糖恒定的關鍵器官，肝糖原是血糖的重要來源。胃腸道吸收的糖30%～60%經肝臟處理并轉化為糖原或氨基酸、脂肪酸，同時肝臟也是胰島素作用的一個重要靶器官［4］。肝功能受損，可影響糖代謝而出現血糖的波動。肝臟的重要生理作用將肝病和糖尿病緊密聯系在一起。相關研究顯示，腫瘤患者中合并糖尿病的比率明顯高于普通人群中合并糖尿病的比率［5，6］。16890例臨床腫瘤患者在初次診斷時患糖尿病，胰腺癌、腎癌、結直腸癌、肝癌患者中糖尿病患病率較高，依次為18．76%、16．76%、12．34%、10．71%，并且腫瘤分期較晚。合并糖尿病的腫瘤患者總體死亡率明顯高于未合并糖尿病患者，其中位生存時間，3年生存率均明顯低于未合并糖尿病患者［7］。所以尋找相關分子標志物早期預測肝癌合并糖尿病，具有重要的臨床意義。近年來，隨著基因組學、轉錄組學等系統生物學方法的大量普及，國外已建立多個腫瘤臨床標本資料、基因表達、基因突變等數據庫，如GEO，TCGA等［8，9］。R語言為開放的編程平臺，為海量數據的提取、統計分析及數據的可視化等提供了可能［10］。以上數據庫含有豐富的臨床標本及完備的臨床資料，為我們研究腫瘤相關分子標志物奠定了充分的數據基礎。

1材料和方法

1．1材料

肝癌組織芯片微陣列(XT16－011)購買自上海芯超生物科技有限公司。CXCL14抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。人胸腎表達趨化因子(BRAK/CXCL14)ELISA試劑盒(EME－H6609)購買自KITZOME(中國深圳)。免疫組化試劑盒購買自碧云天生物技術有限公司(中國上海)。

1．2差異基因的篩選

從GEO及TCGA數據庫中獲得測序數據并檢索相關的研究。數據集搜索僅限于英語，并在2016年11月結束。使用網格術語和自由詞增加搜索的敏感性。搜索詞包括“正常”;“糖尿病”;“肝癌”;“組織”;“腫瘤”或“瘤”或“癌癥”或“癌”。下載包含正常肝組織和肝癌組織的三個GEO數據集(GSE46408，GSE60502，GSE46444)。通過Perl語言集成“系列矩陣文件”及其相應的平臺文件，創建一個包含基因標志及其在每個樣本中的相應表達的新文件。隨后通過limma文庫的R語言分析正常組和肝癌組中的差異基因。從TCGA數據庫下載TCGA－LIHC項目文件，包括374例肝癌組織和50例正常肝組織。通過Perl語言集成“轉錄組分析”;“基因表達定量”;“RNA測序”;“HT測序－計數”以創建一個新文件，包含基因標志及其在每個樣本中的相應表達。隨后通過edgeR文庫的R語言分析正常組和肝癌組中的差異基因。通過維恩圖展示GEO及TCGA數據庫中分析得到的常見差異性基因。

1．3免疫組化染色

CXCL14抗體(1∶200)用于免疫組化檢測組織中CX-CL14的表達情況。實驗步驟詳見參考文獻［11］。使用Olym-pusBX51顯微鏡獲得所有圖像。使用半定量評分方法評價免疫組化染色，兩名病理學家獨立按照染色強度對CXCL14染色進行評分:無染色0分，淺陽性染色1分，中陽性染色2分，強陽性染色3分。陽性染色面積評分為:＜5%0分，5%～25%1分，26%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分。將強度分數乘以表達分數來計算最終分數，評分從0分到12分［11］。

1．4ELISA(酶聯免疫吸附實驗)

經成都醫學院倫理委員會審議批準，患者簽署知情同意書，于成都醫學院腫瘤科收集肝癌合并糖尿病患者血液標本27例(其中12例用于檢測CXCL14表達情況并與正常組、肝癌未合并糖尿病組相比較，15例用于檢測CXCL14表達水平與血糖的關系)，肝癌未合并糖尿病患者血液標本12例，體檢正常人血液標本12例。納入標準:術后病理明確診斷為肝癌;有典型糖尿病癥狀(多尿、多飲和不能解釋的體重下降)者，任意血糖≥11．1mmol/L或空腹血糖(FPG)≥7．0mmol/L，為糖尿病患者;FPG＜6．11mmol/L并且餐后2h血糖＜7．8mmol/L，為正常。排除標準:術前行放化療患者;合并全身疾病或其他原發性腫瘤患者。詳細記錄患者的性別，年齡，病理分期分級等病理資料。將收集的血清樣本儲存在－80℃直至進一步使用。使用ELISA試劑盒(KITZOME，中國深圳)根據制造商的說明書測量血清中CXCL14的水平并定量，每個血清樣本分析三次。

1．5統計學分析

所有統計分析均使用GraphPad5．0軟件完成。定量資料均以均數±標準差(x珋±s)描述，組間比較采用t檢驗。至少進行三次獨立實驗。多組間的比較采用單因素方差分析(OneWayANOVA)檢驗進行分析。檢驗水準α除特別說明外均設定為0．05。

2結果

2．1肝癌合并糖尿病分子標志物的篩選

綜合分析肝癌GEO及TCGA數據庫，選擇含有正常肝組織和肝癌組織的三個GEO數據集(GSE46408，GSE60502，GSE46444)和TCGA－LIHC。維恩圖顯示這四個數據集之間含有21個共同差異性基因(圖1A，B)。選擇含有正常組織及糖尿病組織的兩個GEO數據集(GSE7014，GSE29221)，維恩圖顯示這兩個數據集之間有137個共同差異性基因(圖1C)。將上述篩選出的21個肝癌差異性基因與137個糖尿病差異性基因進行統計分析，維恩圖顯示肝癌與糖尿病共同差異性基因只有一個(圖1D)。由此我們得到肝癌合并糖尿病的共同差異性基因CXCL14。隨后，根據熒光強度半定量檢測CXCL14在以上六個數據集中的表達情況，GSE46408(P=0．0004)，GSE60502(P＜0．0001)，GSE46444(P＜0．0001)，TCGA－LIHC(P＜0．0001)，GSE7014(P=0．0090)，GSE29221(P=0．0015)(圖2)。與正常組相比，肝癌組及糖尿病組中CXCL14表達明顯降低。

2．2CXCL14在組織芯片和血清中的表達情況

為了確定肝癌患者中CXCL14表達的臨床意義，我們進行了免疫組化染色(圖3A)，通過半定量評分方法測量CX-CL14的表達水平。結果顯示肝癌組織中CXCL14的表達明顯低于正常肝組織(P=0．0002)(圖3B)。進一步分析CXCL14在血清中的表達情況，與正常血清相比，肝癌患者血清中CXCL14下調(P=0．0192)，糖尿病患者血清中CXCL14表達水平明顯降低(P=0．0063)(圖3C)。

2．3CXCL14在肝癌合并糖尿病患者中的表達情況

收集正常組，肝癌合并糖尿病組，肝癌未合并糖尿病組血清標本各12例，結果顯示肝癌合并糖尿病患者血清中CXCL14表達明顯低于肝癌未合并糖尿病組，組間分析P＜0．0001(圖4A)，三組間具有明顯差異。檢測15例肝癌患者血清中CXCL14的表達情況，及對應的空腹血糖水平。相關性分析顯示，CXCL14表達越低，血糖水平越高，相關系數r=0．9005，P＜0．0001，CX-CL14表達水平與血糖濃度呈負相關，具有統計學意義。

3討論

隨著生活方式的改變，糖尿病已經成為僅次于惡性腫瘤、心腦血管疾病后，危害人類健康的第三大疾病，其發病率與死亡率呈逐年上升趨勢。在2013年，世界人群范圍中已有3．82億人患有糖尿病，預計到2035年將增加到5．92億［12］。Yancik等臨床研究證實，在校正年齡和分期后，合并糖尿病的乳腺癌患者30個月內死亡率要比未合并糖尿病患者高76%［13］。同時另一項臨床研究表明，在校正年齡、性別、分期后，合并糖尿病的結腸癌患者死亡率增加37%［14］。Meyerhardt等進行的一項隨機輔助化療臨床資料同樣證實，合并糖尿病的287例結腸癌患者死亡危險率增加42%，腫瘤復發率增加21%［15］。所以尋找相關分子標志物，對于早期預測肝癌合并糖尿病具有重要的臨床意義。目前認為CXCL14是一種腫瘤抑制基因，其蛋白的表達缺失與腫瘤發生發展有關［16，17］。正常肝臟組織中CXCL14高表達，肝癌組織中CXCL14的表達顯著下調［18］。研究表明，過表達CXCL14能抑制肝癌細胞的增殖，引起細胞凋亡，抑制細胞的侵襲作用。

慢病毒上調CXCL14的表達，能明顯抑制裸鼠的皮下瘤體生長。上調或重新過表達CXCL14對肝細胞癌的治療具有重要意義［19］。此外，CXCL14可增強胰島素誘導的胰島素受體和胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化［20，21］。由此可見，肝癌患者血清中CXCL14表達降低，CX-CL14的下調可減弱胰島素受體和胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化，降低胰島素敏感性，從而增加患糖尿病的風險。而糖尿病患者血清中CXCL14表達進一步降低，加劇肝癌的進程，進而形成惡性循環，增加患者的死亡率。因此CXCL14的表達水平在肝癌合并糖尿病患者中起重要作用。綜上所述，我們通過GEO及TCGA數據庫檢索分析，篩選得到肝癌合并糖尿病差異性基因:CXCL14，早期檢測肝癌患者血清中CXCL14的表達水平可能作為糖尿病的一個預測指標。但相應的細胞及動物層面的分子機制仍需深入研究，為其臨床轉化奠定相應的分子基礎。同時，CXCL14作為新型肝癌合并糖尿病分子標志物，其參考值范圍及檢測方法也需進一步研究。

作者：張婷；吳東明；許穎