細(xì)菌素生物學(xué)論文范文

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1實驗方法

1.1指示菌的篩選唾液乳桿菌LH1F的新鮮菌液以2%接種量接種于10mLMRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，發(fā)酵液4℃下7000r/min離心20min，得發(fā)酵上清液。采用單層瓊脂平板打孔法檢測其抑菌活性：制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌CMCC44102、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115三種常見指示菌菌懸液（濃度為106CFU/mL），在無菌平皿中加入指示菌菌懸液1mL，倒入約20mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后，用直徑8mm打孔器均勻打孔，向孔內(nèi)加入發(fā)酵上清液0.1mL，于4°C冰箱中擴(kuò)散過夜后，37℃培養(yǎng)12h，測量抑菌圈的直徑（mm）。

1.2菌體細(xì)胞、有機(jī)酸及過氧化氫的排除實驗將唾液乳桿菌LH1F的發(fā)酵上清液用微孔濾膜（孔徑為0.22μm）的細(xì)菌濾器過濾去除菌體細(xì)胞；將無菌體發(fā)酵上清液用1mol/L的NaOH溶液中和至pH5.0；將無菌體發(fā)酵上清液經(jīng)過氧化氫酶處理（酶濃度為10mg/mL，pH7.0，37℃水浴1h），將上述處理的樣品及唾液乳桿菌LH1F原發(fā)酵上清液、pH5.0的乳酸分別做抑菌實驗[8]，比較不同處理抑菌活性的差異。

1.3蛋白酶的敏感性將經(jīng)胰蛋白酶（酶濃度為10mg/mL，pH7.0，37℃水浴2h）、胃蛋白酶（酶濃度為10mg/mL，pH3.0，37℃水浴2h）處理后的無菌體發(fā)酵上清液以及未經(jīng)蛋白酶處理的無菌體發(fā)酵上清液檢測其抑菌活性的差異。

1.4唾液乳桿菌LH1F生理曲線測定唾液乳桿菌LH1F新鮮菌液以2%的接種量接種于150mLMRS培養(yǎng)基中，每隔2h（0~36h）取1mL發(fā)酵液置于離心管中，以MRS培養(yǎng)基作為空白對照，測量OD600nm值和pH，用各個培養(yǎng)時間的發(fā)酵上清液做抑菌實驗，測量抑菌圈的直徑。

1.5唾液乳桿菌LH1F產(chǎn)細(xì)菌素的初步純化向無菌體發(fā)酵上清液分別經(jīng)30%，40%，50%，60%，70%，80%飽和度硫酸銨沉淀，4℃靜置過夜，4℃、7000r/min離心30min，收集沉淀，將沉淀重懸于原體積1/10的pH5.0，0.1mol/L的檸檬酸酸鹽緩沖液中，檢測鹽析上清液與沉淀復(fù)溶液的抑菌活性。將抑菌活性最高的沉淀復(fù)溶液經(jīng)截留分子質(zhì)量3ku的超濾離心管超濾[9]（5000×g，4℃）得濃縮液（M>3ku）及超濾液（M<3ku），分別取原液、濃縮液及超濾液測定抑菌活性。

1.6唾液乳桿菌LH1F產(chǎn)細(xì)菌素的生物學(xué)特性

1.6.1熱穩(wěn)定性細(xì)菌素粗提液樣品分別于60℃、80℃、100℃、121℃條件下熱處理30min（121℃處理樣品置于烘箱，其余溫度置于電熱恒溫水槽），冰浴冷卻后，以未經(jīng)熱處理的樣品為對照，進(jìn)行抑菌實驗，比較抑菌活性的變化情況，確定該細(xì)菌素的溫度穩(wěn)定性。

1.6.2pH穩(wěn)定性分別取0.5mL的細(xì)菌素粗提樣品于離心管中，用1mol/LHCl和1mol/LNaOH分別調(diào)pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，37℃水浴2h后，調(diào)pH至5.0，以MRS培養(yǎng)基用1mol/LHCl和1mol/LNaOH調(diào)至相應(yīng)pH作為對照，做抑菌試驗檢測抑菌活性的變化。

1.6.3蛋白酶敏感性細(xì)菌素粗提樣品用1mol/LHCl和1mol/LNaOH分別調(diào)至各酶的最適pH（胃蛋白酶pH調(diào)至3.0，胰蛋白酶、蛋白酶KpH調(diào)至7.0），加入酶的終濃度為10mg/ml，以同比稀釋的細(xì)菌素粗提樣品作為對照，37℃水浴2h，然后將pH調(diào)回至初始的pH，以未加入酶的發(fā)酵上清液作對照，分析該細(xì)菌素粗提樣品以不同蛋白酶處理后抑菌活性的變化。

1.6.4抑菌譜選取金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌、雞大腸桿菌O-78、大腸桿菌CMCC44102、雞白痢沙門氏菌C-79、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115、黑曲霉、根霉、青霉、啤酒酵母、紅酵母11株菌為指示菌，采用單層瓊脂平板打孔法分別對供試的菌株做抑菌試驗，測試細(xì)菌素粗提樣品的抑菌活性。

2結(jié)果與分析

2.1指示菌的篩選通過單層瓊脂平板打孔法檢測到唾液乳桿菌LH1F的發(fā)酵上清液對三種常見病原指示菌均有一定的抑菌性，結(jié)果見表1，金黃色葡萄球菌作為指示菌培養(yǎng)12h的抑菌效果最為明顯，但與大腸桿菌CMCC44102及鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115的抑菌效果差異不明顯，因此以下抑菌實驗革蘭氏陽性菌采用金黃色葡萄球菌，革蘭氏陰性菌采用大腸桿菌CMCC44102作為指示菌，培養(yǎng)觀察時間為12h。

2.2抑菌物質(zhì)性質(zhì)的確定不同處理對唾液乳桿菌LH1F發(fā)酵上清液抑菌活性的影響結(jié)果如圖1所示：去除菌體細(xì)胞后，該發(fā)酵上清液的抑菌作用與原發(fā)酵上清液差別不大，說明發(fā)酵上清液中的抑菌性不是菌體細(xì)胞作用的結(jié)果；排酸作用后，該發(fā)酵上清液抑菌活性降低，但仍有一定的抑菌作用，而相同pH值的乳酸無抑菌活性，說明發(fā)酵上清液中還有其他抑菌物質(zhì)存在；發(fā)酵上清液經(jīng)過氧化氫酶37℃水浴1h處理后，抑菌活性比處理前的原發(fā)酵上清液小，但仍保留了較強(qiáng)的抑菌作用，說明發(fā)酵上清液中過氧化氫不是主要的抑菌物質(zhì)，還有其他的抑菌物質(zhì)存在。發(fā)酵上清液經(jīng)過胃蛋白酶處理后，抑菌活性下降22.22%，發(fā)酵上清液經(jīng)過胰蛋白酶處理后，抑菌活性下降了19.44%，抑菌物質(zhì)對蛋白酶較敏感，說明抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，初步確定為肽類細(xì)菌素。

2.3唾液乳桿菌LH1F生理曲線的測定將唾液乳桿菌LH1F的新鮮種子液按2%的體積比接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)后每隔2h取樣，測定OD600nm值，pH和上清液的抑菌活性，該菌株的生理曲線（0~36h）的測定結(jié)果如圖2，菌株置于37℃培養(yǎng)，2~6h即進(jìn)入對數(shù)生長期，12h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。發(fā)酵上清液的pH在發(fā)酵2h后開始發(fā)生變化，2~8hpH迅速下降，從4.8降至3.5，8~20hpH緩慢下降，從3.5降至3.0，12h后恒定在pH3.0。在對數(shù)期生長前期（4h）開始產(chǎn)生細(xì)菌素，進(jìn)入對數(shù)生長期（4~12h）后細(xì)菌素產(chǎn)量持續(xù)增加，培養(yǎng)16h的細(xì)菌素產(chǎn)量達(dá)到最大值，此時抑菌活性達(dá)到最高，隨后保持穩(wěn)定，整個過程受pH的影響較小，結(jié)果表明唾液乳桿菌LH1F在對數(shù)生長前期就產(chǎn)生細(xì)菌素。

2.4唾液乳桿菌LH1F細(xì)菌素的初步純化硫酸銨沉淀后，分別用鹽析上清液和沉淀復(fù)溶液作抑菌試驗，結(jié)果如圖3所示，硫酸銨飽和度為30%及40%時鹽析所得的上清液均有抑菌效果，30%飽和度的抑菌效果比40%的好，而且30%飽和度鹽析所得的上清液抑菌效果比沉淀復(fù)溶液要好，說明30%飽和度硫酸銨不能較好地沉淀唾液乳桿菌LH1F所產(chǎn)的細(xì)菌素。隨著硫酸銨鹽飽和度的增大，沉淀復(fù)溶液抑菌效果增強(qiáng)并在60%時達(dá)到最佳，70%，80%飽和度時沉淀復(fù)溶液抑菌效果有所下降。因此，可以進(jìn)一步確定抑菌物質(zhì)主要為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，鹽析的硫酸銨飽和度為60%時效果最佳。將所得的沉淀復(fù)溶液經(jīng)截留分子量為3ku的超濾離心管超濾后，取原液、濃縮液及超濾液分別測定其抑菌活性。結(jié)果顯示，濃縮液的抑菌活性比原液（粗提液）強(qiáng)，而超濾液僅具有微弱的抑菌圈，表明絕大部分細(xì)菌素能被3ku截留分子量的超濾管截留。

2.5唾液乳桿菌LH1F產(chǎn)細(xì)菌素的特性研究

2.5.1熱穩(wěn)定性唾液乳桿菌LH1F所產(chǎn)細(xì)菌素在不同的溫度下進(jìn)行處理，檢測抑菌活性，熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明(圖4)，隨著溫度的升高，細(xì)菌素的殘余活性有所降低，但抑菌活性變化不是很大，樣品經(jīng)60~80℃處理30min，抑菌活性保留95.9~91.8%之間；經(jīng)100℃處理30min后，抑菌活性保留87.8%，而經(jīng)121℃處理30min后，其抑菌活性仍保留在75.5%，該細(xì)菌素表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，與文獻(xiàn)報道[7]的唾液乳桿素均屬于第Ⅱ類細(xì)菌素（分子量小于10ku的小分子熱穩(wěn)定肽）相符。食品加工中常用的巴氏殺菌條件為65~80℃15min，而此細(xì)菌素在巴氏殺菌的條件下仍保持90%以上的高活性，顯示出其在食品加工中的廣泛應(yīng)用前景。

2.5.2pH穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明(表2)，唾液乳桿菌LH1F所產(chǎn)細(xì)菌素在偏酸的環(huán)境中有較強(qiáng)的抑菌性，活性pH范圍為2.0~5.0，pH越低，活性越強(qiáng)，pH為2.0時抑菌活性最強(qiáng)，當(dāng)pH>6.0時，細(xì)菌素基本沒有抑菌性，說明所產(chǎn)細(xì)菌素在酸性條件下有較好的穩(wěn)定性,，而在中性或堿性條件下即會失活。

2.5.3對蛋白酶的敏感性唾液乳桿菌LH1F所產(chǎn)細(xì)菌素樣品分別經(jīng)不同的酶在37℃條件下處理2h，檢測抑菌活性，以確定該細(xì)菌素的蛋白酶敏感性。結(jié)果表明（圖5），樣品產(chǎn)生的細(xì)菌素對蛋白酶敏感，經(jīng)胃蛋白酶處理后抑菌活性下降約35%，經(jīng)胰蛋白酶處理后抑菌活性下降約30%，經(jīng)蛋白酶K處理后抑菌活性下降約21%，說明該抑菌物質(zhì)是蛋白類物質(zhì)，可被蛋白酶降解而不會在體內(nèi)殘留，作為食品防腐劑使用安全性相對較高。

2.5.4抑菌譜的測定用粗提樣品分別對供試的G+菌株、G-及部分真菌做抑菌實驗，結(jié)果表明（表3），唾液乳桿菌LH1F所產(chǎn)細(xì)菌索不僅對供試的1株金黃色葡萄球菌、1株蘇云金芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用，對2株大腸桿菌、2株沙門氏菌等革蘭氏陰性菌也有較強(qiáng)的抑制作用，但是對酵母菌及曲霉、青霉、根霉等霉菌未見有抑制作用。該細(xì)菌索有較寬的抑菌譜，不僅對芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有明顯抑制作用，同時對大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌也表現(xiàn)抑菌活性，可廣泛用于食品的防腐殺菌處理。

3結(jié)論

乳酸菌在代謝過程中除細(xì)菌素外，還能產(chǎn)生乙酸、乳酸及過氧化氫等具有抑菌活性的物質(zhì)。唾液乳桿菌LH1F分離自從豬腸道內(nèi)容物，其發(fā)酵上清液在排除菌體細(xì)胞、有機(jī)酸、過氧化氫干擾后，仍然保留較強(qiáng)的抑菌活性，經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋自酶處理后，抑菌活性降低，表明抑菌成分為細(xì)菌素。發(fā)酵上清液經(jīng)60%硫酸按鹽析及超濾初步純化，特性實驗研究結(jié)果顯示：唾液乳桿菌LH1F產(chǎn)生的細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性，隨著溫度的升高，細(xì)菌素的殘余活性有所降低，但抑菌活性變化不是很大，121℃處理30min仍有保持75.5%的抑菌活性；在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，作用效果也較好，在中性或堿性條件下抑菌活性減弱或喪失，pH的活性范圍是pH2.0~5.0；對胃蛋白酶較為敏感，抑菌活性下降約35%，經(jīng)胰蛋白酶處理后抑菌活性下降約30%，經(jīng)蛋白酶K處理后抑菌活性下降約21%；唾液乳桿菌LH1F在對數(shù)生長前期就會產(chǎn)生細(xì)菌素，進(jìn)入對數(shù)生長期后細(xì)菌素產(chǎn)量持續(xù)增加，整個過程受pH的影響較?。辉摷?xì)菌素具有較廣的抑菌譜，對供試的金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌等多種革蘭氏陽性菌及大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌抑制作用明顯，但對酵母菌及常見霉菌未見有抑制作用，具有作為食品生物防腐劑的潛在應(yīng)用價值。該細(xì)菌素與上述報道的Ⅱb類唾液乳桿素具有一些共同特征，但是該細(xì)菌素是否一種新的Ⅱb類唾液乳桿素，還有待進(jìn)一步的研究。

作者：李雪玲鄧綺敏羅少雯許瑞美羅奕慧胡文鋒單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院