人乳頭瘤病毒感染與結(jié)直腸癌相關(guān)性研究范文

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摘要：目的檢測(cè)195例結(jié)直腸癌樣本中人乳頭瘤病毒（HPV）的感染情況。方法利用通用PCR法檢測(cè)結(jié)直腸癌樣本中的HPVDNA，隨后用熒光定量PCR和直接測(cè)序法對(duì)HPVDNA陽(yáng)性樣本進(jìn)行HPV分型，同時(shí)統(tǒng)計(jì)HPV陽(yáng)性標(biāo)本的Kras、PIK3CA和BRAF基因突變情況和臨床病理特征。結(jié)果結(jié)直腸癌標(biāo)本中HPV感染陽(yáng)性率為17.94%（35/195），以HPV16、18型感染為主，且存在混合感染；HPV感染陽(yáng)性標(biāo)本中Kras基因突變率為42.85%，PIK3CA、BRAF基因突變率均為2.86%，HPV感染與三個(gè)基因突變的相關(guān)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；陽(yáng)性標(biāo)本中以右半結(jié)腸的癌變居多，癌組織以中分化為主，臨床Ⅱ期多見，多無(wú)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。結(jié)論HPV感染可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，但與Kras、PIK3CA、BRAF基因突變無(wú)關(guān)。

關(guān)鍵詞：人乳頭瘤病毒；結(jié)直腸癌；通用PCR；突變

結(jié)直腸癌已成為最常見的惡性腫瘤之一，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有研究表明結(jié)直腸癌的發(fā)生可能與人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）的感染有關(guān)，但一些研究結(jié)果的檢出率低或未檢測(cè)到HPV病毒，這可能與人群種族、標(biāo)本來(lái)源、標(biāo)本數(shù)量及檢測(cè)方法有關(guān)。另有資料顯示Kras、PIK3CA和BRAF基因突變與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此本研究利用針對(duì)HPVL1區(qū)通用引物的PCR法檢測(cè)結(jié)直腸癌樣本中HPV⁃DNA的存在情況，并用熒光定量PCR和直接測(cè)序法對(duì)HPV陽(yáng)性樣本進(jìn)行分型，同時(shí)調(diào)查Kras、PIK3CA和BRAF基因突變與結(jié)直腸癌HPV感染的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1樣本來(lái)源

收集2014年7月至2016年6月共195例結(jié)直腸癌標(biāo)本，均來(lái)自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院手術(shù)病人。其中男性114名，女性81名，中位年齡62歲。

1.2主要試劑和儀器

人乳頭瘤病毒檢測(cè)試劑盒和人乳頭瘤病毒核酸分型熒光PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自潮州凱普生物化學(xué)有限公司；DNA提取試劑盒、Kras基因突變檢測(cè)試劑盒、PIK3CA基因突變檢測(cè)試劑盒和BRAF基因突變檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；超微紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermofisherscientific公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABAppliedBiosystems公司；ABI7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Life公司。

1.3方法

1.3.1腫瘤組織DNA提取

組織切片經(jīng)病理評(píng)估合格后，嚴(yán)格按照廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司的DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行腫瘤組織DNA提取。所提DNA經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量和濃度，DNA的A260/A280在1.8~2.0之間，DNA-20℃保存。

1.3.2通用PCR法篩查

PCR反應(yīng)體系共25μl，包括23.25μlPCR混合液、0.75μlDNATaq酶、1μlDNA模板。陽(yáng)性對(duì)照為HPV18克隆質(zhì)粒，內(nèi)參為globin基因，陰性對(duì)照為ddH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)熱9min，95℃20s，55℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

1.3.3熒光定量PCR法HPV分型

熒光定量PCR反應(yīng)體系共25μl，包括17.50μlPCR混合液、0.50μlDNA聚合酶、2μlDNA樣本。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)熱10min，95℃15s，60℃60s，45個(gè)循環(huán)，最后38℃延伸5s。熒光信號(hào)采集點(diǎn)設(shè)在60℃60s，儀器運(yùn)行中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，儀器運(yùn)行結(jié)束后直接在熒光定量PCR檢測(cè)儀上讀取熒光值。當(dāng)空白對(duì)照Ct值下顯示為Undet，陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤36，實(shí)驗(yàn)才視為有效。

1.3.4瓊脂糖凝膠電泳

配制2%瓊脂糖凝膠，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl與1μlLoddingBuffer混合后，加入凝膠板上的加樣孔。電壓120V/cm，電泳30min。電泳完畢取出凝膠，采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.3.5PCR產(chǎn)物序列測(cè)定

將初篩陽(yáng)性結(jié)果切膠回收，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒提純出目的DN段，用超微紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量回收的DNA濃度。純化的PCR產(chǎn)物送至潮州凱普生物化學(xué)有限公司進(jìn)行測(cè)序。1.3.6Kras、PIK3CA和BRAF基因突變按Kras基因突變檢測(cè)試劑盒、PIK3CA基因突變檢測(cè)試劑盒和BRAF基因突變檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行加樣，三個(gè)項(xiàng)目都可用同一個(gè)程序，PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95℃5min，1個(gè)循環(huán)：95℃25s，64℃20s，72℃20s，15個(gè)循環(huán)；93℃25s，60℃35s，72℃20s，31個(gè)循環(huán)。在第三階段60℃收集信號(hào)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析HPV陽(yáng)性標(biāo)本與Kras、PIK3CA和BRAF基因突變關(guān)系用配對(duì)四格表的χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1通用PCR法篩查HPV⁃DNA檢測(cè)結(jié)果

通用PCR法篩查195例結(jié)直腸癌標(biāo)本，初篩陽(yáng)性的標(biāo)本35例，初篩陽(yáng)性率為17.94%（35/195）。結(jié)直腸癌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果顯示在450bp出現(xiàn)目的條帶。

2.2熒光定量

PCR和直接測(cè)序法檢測(cè)HPV⁃DNA對(duì)HPV初篩陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR和直接測(cè)序，證實(shí)均存在HPV感染，以HPV16、18型感染為主，且存在HPV混合感染。2.3HPV感染與Kras、PIK3CA和BRAF基因突變的相關(guān)性HPV感染陽(yáng)性標(biāo)本中Kras基因突變率為42.86%（15/35），PIK3CA基因突變率為2.86%（1/35），BRAF基因突變率為2.86%（1/35）。在結(jié)直腸癌病例中，HPV感染率分別與Kras、PIK3CA和BRAF基因的突變率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、（P>0.05），說(shuō)明HPV感染與三個(gè)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的突變可能無(wú)關(guān)，見表2。2.4HPV感染與結(jié)直腸癌病理特征的關(guān)系HPV感染陽(yáng)性標(biāo)本中以右半結(jié)腸的癌變居多（23/35），其次為直腸（10/35）；癌組織以中分化為主（32/35）；臨床分期以Ⅱ期多見（19/35），其次為Ⅳ期（8/35）；病例中多無(wú)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移（25/35）。

3討論

HPV病毒是一種嗜上皮細(xì)胞病毒，主要感染皮膚黏膜的上皮細(xì)胞，與上皮來(lái)源腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。HPV病毒DNA由上游調(diào)節(jié)區(qū)（URR）、早期轉(zhuǎn)錄區(qū)（E區(qū)）和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)（L區(qū)）組成。其中E區(qū)包括6個(gè)開放閱讀框，依次為E1、E2、E4、E5、E6、E7，與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。L區(qū)包括L1、L2，其中HPV⁃DNA的L1區(qū)為最為保守的區(qū)域。在宮頸癌中，HPV檢出率達(dá)到90%以上。近年國(guó)內(nèi)外有研究報(bào)道HPV感染與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，但相關(guān)的研究結(jié)果差異較大。Li等采用基因芯片方法檢測(cè)結(jié)直腸腺癌，HPV感染率為48.4%；Bernabe⁃Dones等采用巢式PCR方法在西班牙浸潤(rùn)性結(jié)直腸癌檢出率為42.2%；Burnett⁃Hartman等采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法在西雅圖555例結(jié)直腸癌標(biāo)本中檢出率只有2%；Gazzaz等用雜交捕獲的方法檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性率為0.8%。其原因可能與人群種族、標(biāo)本來(lái)源、標(biāo)本數(shù)量及檢測(cè)方法相關(guān)，同時(shí)病理標(biāo)本經(jīng)石蠟的包埋后會(huì)造成DNA的降解，造成陽(yáng)性率降低也是不容忽視的。在Lorenzon等報(bào)道中，雖然HPV⁃16在結(jié)直腸感染率達(dá)到57.1%，但其用含有完整游離HPV16基因的細(xì)胞株作比對(duì)，對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本中HPV⁃16基因進(jìn)行相對(duì)定量，卻發(fā)現(xiàn)非常低的量在組織中，其認(rèn)為不排除從肛門或臨床處理過(guò)程中污染的結(jié)果。

認(rèn)為病毒將其E6、E7基因整合到癌細(xì)胞的DNA中，其余基因大多數(shù)丟失或者呈游離狀態(tài)，以E6、E7以外的基因?yàn)槟康膮^(qū)域進(jìn)行檢測(cè)將導(dǎo)致低陽(yáng)性率或出現(xiàn)陰性結(jié)果。HPV病毒的檢測(cè)方法有原位雜交、基因芯片法以及以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法等。其中原位雜交法敏感性較低，方法費(fèi)時(shí)；基因芯片法靈敏度高，但費(fèi)用較高；PCR法靈敏度及特異性都較高，且其中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR能進(jìn)行定量和分型的優(yōu)點(diǎn)。本研究針對(duì)L1區(qū)保守區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物，通過(guò)PCR方法篩選出陽(yáng)性標(biāo)本再進(jìn)行熒光定量PCR和直接測(cè)序分型。同時(shí)調(diào)查Kras、PIK3CA和BRAF基因突變情況與結(jié)直腸癌HPV感染是否有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽(yáng)性率為17.94%，HPV感染的主要型別為HPV16、18型，且存在混合感染，提示結(jié)直腸癌與HPV感染有一定的關(guān)系，這與Laskar等結(jié)果是相一致。陽(yáng)性標(biāo)本中Kras基因突變率為42.85%，PIK3CA、BRAF基因突變率均為2.85%，HPV感染與三個(gè)基因突變的相關(guān)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，本研究顯示HPV感染可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，但目前沒(méi)有研究明確表明HPV參與了結(jié)直腸癌的發(fā)展，HPV感染如何導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生還有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］羅妙玲，徐韞健.結(jié)直腸癌KRAS、BRAF及PIK3CA基因突變狀態(tài)分析［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2016，16（7）：843-846.

作者：李志陽(yáng)1；陳舒穎1；張先言2 單位：1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，2.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院