大腸癌細胞生長的影響機制范文

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【摘要】

目的探討VEGF對大腸癌細胞生長的影響機制研究。方法采用基因芯片方法，篩選大腸癌的相關(guān)因子。采用免疫組化方法檢測大腸癌組織、癌旁組織和正常組織中VEGF的表達。采用免疫熒光方法檢測三種組織內(nèi)淋巴管和血管中VEGF的表達。結(jié)果基因芯片篩選結(jié)果顯示VEGF在大腸癌組織中呈高表達。免疫組化結(jié)果顯示22例大腸癌組織中VEGF呈高表達，與正常組織比較，具有統(tǒng)計學意義，P＜0．05。免疫熒光檢測結(jié)果顯示在癌組織中呈高表達VEGF時其淋巴管和血管內(nèi)均增高(相比于正常組時)，且有統(tǒng)計學差異，(分別為P＜0．001和P＜0．05)，在癌旁組織中VEGF呈低表達(相比于癌組織)時相對癌組織，淋巴管和血管內(nèi)均降低，且有統(tǒng)計學差異(分別為P＜0．001和P＜0．05)。結(jié)論VEGF可以通過調(diào)節(jié)淋巴內(nèi)皮細胞進行促進大腸癌細胞的生長。

【關(guān)鍵詞】

血管表皮生長因子;腸癌;淋巴管

在西方國家中，結(jié)腸癌在腫瘤疾病中處于第二難治愈腫瘤。結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中上升至第三位，我國和全世界范圍的發(fā)病率和死亡率仍處于上升趨勢［1］。盡管預(yù)防措施和治療手段不斷改進，但轉(zhuǎn)移患者5年的生存率低于10%［2-3］，及時控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展和抑制轉(zhuǎn)移是提高生存率的有效手段。它的擴散有很多方式，淋巴管的浸潤和轉(zhuǎn)移是其最為常見的方式［4-5］。表皮生長因子刺激增殖，促進淋巴管的生成和血管新生。據(jù)研究表明，VEGF在腫瘤組織中的表達和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，早期的研究表明VEGF家族和其受體在腸癌中會引起腸癌細胞的浸潤，而且有人證實VEGF的高表達是促進了其腫瘤相關(guān)的淋巴管擴張，因此在腸癌轉(zhuǎn)移抑制淋巴管的生成中成為一個很有效的方式［6］。所以我們需要證實在腸癌中是否VEGF會引起淋巴管和血管的變化，進而引起腸道腫瘤的變化，因此我們對此展開研究。

1材料與方法

1．1臨床資料收集我院普外科大腸癌患者樣本22例，男性13例，女性9例，年齡35～78歲，平均(55．3±9．8)歲，高分化腺癌6例，中分化腺癌12例，低分化腺癌4例。分別取腫瘤組織相對應(yīng)的癌旁組織和正常組織作為對照，檢測VEGF的表達水平。

1．2方法

1．2．1RT-PCR試劑及方法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，稱取等量組織或血清，加入同等比例的Trizol，12000r/min，4℃離心10min;吸取上清液至一新的EP管中，靜置5min，使之充分裂解;加入200μL氯仿，劇烈震蕩15s，然后放置3min;12000r/min，4℃離心15min，離完后分為3層，取最上層(中間一層為蛋白)至一新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒數(shù)次，室溫沉淀10min;12000r/min，4℃離心10min，棄上清液;加入75%乙醇(DEPC水溶解)，顛倒數(shù)次混勻;7500r/min，4℃5min，棄上清液，小心吸盡液體(此時可以看到白色沉淀即為RNA);RNA略干后加入20μLDEPC水。采用(Ambion公司)小分子分離試劑盒分理處小分子RNA，基因芯片購自于AffymetrixHumanGeome公司。

1．2．2免疫組化［7］①脫蠟:按照常規(guī)脫蠟方法，在二甲苯，無水乙醇，95%乙醇，90%乙醇，85%乙醇，80乙醇脫蠟，大約每次時間為10min。②抗原修復(fù):PBS洗后，加入3%H2O2，37℃浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，PBS洗，再加入檸檬酸緩沖液，高溫高壓修復(fù)5min，冷卻至室溫。③血清封閉:PBS洗，5min，洗3次，擦干組織周圍的PBS液，然后10%BSA封閉，放入37℃溫箱中1小時。④加一抗:將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，加完一抗(VEGF，購自于santa)后于4℃冰箱中保存過夜。⑤加二抗:將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37℃溫箱中1h。⑥加顯色劑:將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上DAB顯色劑。

1．2．3免疫熒光染色組織經(jīng)過固定后，蔗糖梯度脫水，冰凍切片，切片厚度為6μm，高溫修復(fù)5min，待其冷卻后，PBS洗滌(3次，每次5min)，10%BSA封閉50min，然后進行一抗染色，過夜，第二天復(fù)溫40min，PBS洗滌(3次，每次5min)，然后進行熒光二抗染色，一抗為VEGF(抗兔)，購自于santa，1∶100，標記血管內(nèi)皮細胞，LYVE-1(抗羊)，購自于santa1∶100，二抗分別選用，抗兔(595nm)，抗山羊(488nm)。

1．3統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS11．0統(tǒng)計軟件包處理，統(tǒng)計學方法采用t檢驗，Pearson相關(guān)分析，χ2檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2．1血管表皮生長因子在大腸癌組織中呈高表達研究發(fā)現(xiàn)所提取的RNA純度較高，且未出現(xiàn)降解等情況。采取28s和18s的比例，28s和18s是真核生物rRNA(核糖體RNA)的兩個主要亞基，在體內(nèi)含量較多。28s/18s即為衡量提取的RNA完整性的指標，如果28s/18s為1．8～2．0表明所提取RNA完整性較好，基本無降解發(fā)生。電泳條帶上應(yīng)是28s在上，18s在下，且亮度為28s是18s的兩倍，見圖1。將正常組織和大腸癌組織進行基因芯片的篩選，在篩選中我們發(fā)現(xiàn)VEGF在大腸癌組織中呈高表達，見圖2。

2．2大腸癌組織和正常組織中VEGF的表達(圖3)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，22例大腸癌組織中VEGF呈高表達，與正常組織比較，具有統(tǒng)計學意義，P＜0．05。

2．3不同組織中VEGF的檢測分別檢測正常組織、癌旁組織和大腸癌組織中的VEGF表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在癌組織中VEGF呈高表達時其淋巴管和血管內(nèi)表達水平均增高(相比于正常組織時)，且有統(tǒng)計學差異(分別為P＜0．001和P＜0．05)，在癌旁組織中VEGF呈低表達(相比于癌組織)時相對癌組織，淋巴管和血管內(nèi)其表達水平均降低，且有統(tǒng)計學差異(分別為P＜0．001和P＜0．05)，見圖4。

3討論

大腸癌是人類疾病中惡性程度較高的一類疾病，其主要特點是易發(fā)生轉(zhuǎn)移，特別是淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移的腫瘤通過血液，淋巴管，進而形成多種其他腫瘤，淋巴管的轉(zhuǎn)移包括一系列的復(fù)雜過程，包括，①原位癌惡性腫瘤細胞擴散至旁邊淋巴管;②腫瘤細胞通過淋巴管轉(zhuǎn)運至鄰近的淋巴結(jié);③腫瘤細胞在淋巴結(jié)中的著落;④轉(zhuǎn)移性的腫瘤在淋巴結(jié)中的擴散［8］。在最近的研究多集中在VEGF家族在大腸癌中的作用，特別是VEGF-C，VEGF-C是在1996年從人前列腺癌PC-3細胞株中分離出來，其位于染色體4q34，在其編碼外端有7個外顯子，是人類第一格發(fā)現(xiàn)的具有促進淋巴管生成的基因［9-10］。VEGF具有誘導(dǎo)淋巴管生成和血管新生的潛能，且能調(diào)節(jié)生理性的和病理性的血管新生，因此VEGF在腫瘤發(fā)生發(fā)展和生長中發(fā)揮著重要作用［11］。VEGF主要在血管中表達，它的主要作用就是集中在促進血管新生方面，在腫瘤區(qū)域，血管新生是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要原因，所以研究VEGF在腸癌中的研究就顯得尤為重要。基于此本研究展開在大腸癌中進行VEGF的研究，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中高表達VEGF時其淋巴管和血管內(nèi)均增高(相比于正常組時)，且有統(tǒng)計學差異，(分別為P＜0．001和P＜0．05)，為了證實這種結(jié)果是VEGF造成的，我們看到在癌旁組織中VEGF低表達(相比于癌組織)，果然在低表達VEGF時其相對癌組織，淋巴管和血管內(nèi)均降低，所以我們得出結(jié)果VEGF可以通過調(diào)節(jié)淋巴內(nèi)皮細胞進行促進大腸癌細胞的生長。

通過本研究其很多同仁的研究必將更加證實VEGF與大腸癌細胞生長的關(guān)系，筆者認為在今后研究愈加深入后VEGF極有可能成為抑制大腸癌細胞生長的靶向藥物。

作者：王益 張晶 劉蓓 單位：武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院