大腸桿菌基因型檢測及耐藥性分析范文

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《經濟動物學報》2014年第二期

1材料

1．1菌株質控菌:大腸桿菌ATCC25922，購自中國獸醫藥品監察所;臨床菌株:來源于扎龍自然保護區。

1．2藥品阿莫西林/克拉維酸(A/C)、氨芐西林(AMP)、頭孢他定(CAZ)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻吩(CEF)、環丙沙星(CIP)、氨曲南(AZT)、慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、氟哌酸(NOR)、恩諾沙星(EN)、氧氟沙星(OFX)、四環素(TET)、多西環素(DO)、氯霉素(CMP)、復方新諾明(SXT)、多粘菌素B(POL)，均購自杭州天和微生物試劑有限公司;頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/Clav)和頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/Clav)，購自北京天壇藥物生物技術開發公司。安普霉素(APR)、氟苯尼考(FFC)藥敏片購自Oxid公司。

2方法

2．1藥敏試驗采用K－B法檢測40株鶴源大腸桿菌對17種抗菌藥物的耐藥性。

2．2ESBLs檢測以大腸桿菌ATCC25922作陰性對照。按CLSI［4］標準操作和判斷。以紙片擴散法進行初篩試驗。通過表型確證試驗，確認為產ESBLs菌株。根據試劑盒說明提取質粒DNA，進行基因檢測。

3結果

3．1ESBLs檢測結果對40株鶴源大腸桿菌進行ESBLs檢測，在初篩試驗中，有15株大腸桿菌檢測為疑似產ES-BLs菌株。經確證試驗，15株疑似菌株均為產ESBLs菌株，檢出率為37．5%(15/40)。

3．2ESBLs基因型的檢測結果以40株臨床分離的鶴源大腸桿菌的質粒DNA為模板進行SHV、CTX－M、TEM、OXA不同基因型檢測，具體見圖1～4。TEM基因PCR檢出的陽性率為40%;CTX－M基因檢出的陽性率為33．33%;SHV基因檢出的陽性率3．33%;OXA基因檢出的陽性率為13．33%。

3．3藥敏試驗結果不同藥物對40株雞大腸桿菌耐藥率見圖5。對β－內酰胺類藥物，15株產酶菌的耐藥率均比25株不產酶菌高，其中產酶菌對AMP耐藥率最高為60%。40株菌對A/C、AZT和FFC高度敏感，敏感率均達100%。

4討論

各個國家和地區ESBLs檢出率明顯不同。在美國，腸桿菌科細菌產ESBLs菌株的檢出率平均3%左右［5］。在中國，苑麗等［6］對河南省7個地區不同雞場臨床分離31株受試菌中有29株菌檢出相關β－內酰胺酶基因，共檢出TEM型21株，CTX－M型15株。本試驗對40株臨床分離鶴源大腸桿菌進行ESBLs檢測，共檢出15株為產ESBLs菌。TEM基因、SHV基因、CTX－M基因和OXA基因均檢測出。PCR結果顯示，40株鶴源大腸桿菌中TEM型擴增陽性率為40%，是扎龍自然保護區主要的β－內酰胺酶型別。這與許穎等［7］檢出的產ESBLs大腸桿菌主要型別為TEM型，其對青霉素類抗生素具有較強的耐藥性的結果相似。TEM型ESBLs最初僅存在大腸桿菌和肺炎克雷伯中，但由于耐藥質粒的水平傳播及耐藥基因的轉座、重組作用，近年來在多種細菌中同時檢出TEM型。OXA型ESBLs國內外文獻報道主要存在于銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌中［8］，但是本試驗在黑龍江鶴源大腸桿菌中檢出OXA型基因。原因可能是耐藥質粒上所攜帶的OXA型基因通過水平傳播給大腸桿菌。

為了降低養殖場畜禽感染的發生率，應合理應用抗菌藥物，能用窄譜抗菌藥物控制的感染盡量不用廣譜抗菌藥物，以減少耐藥菌株和二重感染的發生。同時應加強對養殖場和自然保護區畜禽感染菌株耐藥性監測，研究耐藥基因分子流行病學規律，切斷耐藥質粒傳播途徑，嚴格控制抗菌藥物使用，降低動物感染的發生率［9-10］。鑒于耐藥菌耐藥基因可通過接合、轉化、轉導等多種方式發生轉移，最終導致耐藥菌株的暴發流行，對疾病的預防和治療帶來極大困難，必須高度重視對產ESBLs菌的預防和控制。

作者：牛鑫鑫劉闖唐連友劉婷婷薛原華育平單位：東北林業大學野生動物資源學院