EB病毒在大腸桿菌中的表達(dá)范文

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《生物技術(shù)通報(bào)雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和宿主菌pGEX5T-BZLF1-BMRF1質(zhì)粒、表達(dá)菌BL21（DE3）由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供，表達(dá)載體pET32a購(gòu)自Novagen公司。

1.1.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)pGEX5T-BZLF1-BMRF1測(cè)序結(jié)果，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游：5''''-GGAATTCCATATGGATCCGAACTCTACTTCTG-3''''（下劃線為NdeⅠ酶切位點(diǎn)）；下游：5''''-CCGCTCGAGGATCAGTGGATTAAATGCCTGC-3''''（下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。

1.1.3主要試劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自Sigma公司；蛋白Marker、Taq酶、dNTPs、DNAMarker、T4DNA連接酶購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；鼻咽癌患者的血清取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院；限制性?xún)?nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ購(gòu)自NewEnglandBiolabs公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自寶生物公司，Ecl化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自PIERCE公司，PVDF轉(zhuǎn)印膜購(gòu)自PALL公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1目的基因擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)所設(shè)計(jì)引物，建立30μLPCR反應(yīng)體系：（5×buffer，6μL；MgCl2，1μL；dNTP，0.3μL；上游引物，0.2μL；下游引物，0.2μL；Taq酶，0.5μL；模板，0.5μL；ddH2O，21.3μL），反應(yīng)條件：95℃5min；95℃1min；60℃35s；72℃1.5min；40個(gè)循環(huán)，72℃5min。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pET32a載體分別經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的基因條帶，用DNA膠回收試劑盒分別回收目的片段和載體片段。由T4DNA連接酶16℃過(guò)夜連接雙酶切產(chǎn)物，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞BL21（DE3）中，涂布于固體LB培養(yǎng)基中（含Amp），37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆菌落培養(yǎng)至OD值0.6左右，提取質(zhì)粒，將提取質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切正確的產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，將測(cè)序正確地質(zhì)粒命名為pET32a/BZLF1-BMRF1。

1.2.2重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化挑取陽(yáng)性菌落，接種于3.5mLLB液體培養(yǎng)基（含Amp）中，37℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)，次日取菌液100μL轉(zhuǎn)接到含有氨芐抗生素的3.5mLLB培養(yǎng)基中。當(dāng)培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，以空載體pET32a作為對(duì)照。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)對(duì)菌體進(jìn)行溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件的優(yōu)化，對(duì)不同表達(dá)條件的菌體進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，選取最優(yōu)表達(dá)條件。

1.2.3表達(dá)菌體的純化前期處理取穩(wěn)定表達(dá)的菌種1mL接種到1L的LB液體培養(yǎng)基（含Amp）中，在最佳條件下誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體。用pH7.86mol/L尿素重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎。離心，取上清進(jìn)行飽和硫酸銨沉淀，離心，取沉淀透析出去硫酸銨，用pH7.86mol/L尿素溶解沉淀。將處理過(guò)的菌液進(jìn)行DEAE-SepharoseCL-6B和Ni-NTA親和層析純化。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化蛋白的含量，按以下公式計(jì)算蛋白濃度：蛋白濃度（mg/mL）=A280×1.45-2A260×0.74。

1.2.4融合蛋白Zta-P54的DEAE-SepharoseCL-6B純化柱床體積40mL（3.5×4cm）pH8.850mmol/L的Tris-HCl，4mol/L的尿素平衡柱子，用5倍柱體積的0.1、0.5、1.0、2.0mol/LNaCl，pH8.850mmol/L的Tris-HCl，4mol/L的尿素進(jìn)行線性梯度洗脫，流速1.5mL/min，收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。并通過(guò)Photoshop分析蛋白灰度并計(jì)算蛋白純度。

1.2.5融合蛋白Zta-P54的Ni-NTA親和柱純化將DEAE-SepharoseCL-6B柱純化的最佳洗脫蛋白經(jīng)AKTAPrimeplus純化儀泵入Ni-NTA親和柱純化，柱床體積25mL（2.5×5cm）pH8.850mmol/L的Tris-HCl，4mol/L的尿素平衡柱子，用5倍柱體積的20、50、100、200mmol/L咪唑，pH8.850mmol/L的Tris-HCl，4mol/L的尿素進(jìn)行線性梯度洗脫，流速1.5mL/min，收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。分析蛋白灰度并計(jì)算蛋白純度。

1.2.6Westernblot檢測(cè)蛋白特性相同上樣量的前期試驗(yàn)純化的包涵體融合蛋白Zta-P54和本試驗(yàn)純化后融合蛋白Zta-P54，經(jīng)SDS-PAGE，切膠轉(zhuǎn)膜處理，用10mg/L的BSA封閉2h。PBST洗滌4次。加入鼻咽癌患者陽(yáng)性血清為一抗陽(yáng)性對(duì)照，空質(zhì)粒為陰性對(duì)照，37℃溫浴1.5h，PBST洗膜4次。加入HRP標(biāo)記的鼠抗人-IgG作為二抗，37℃溫浴2h，PBST清洗后，再用蒸餾水清洗，然后加入Ecl化學(xué)發(fā)光顯色液顯色5min，暗室曝光1min，顯影1min定影6min，最后結(jié)果分析并拍照記錄。

2結(jié)果

2.1重組基因的核酸電泳鑒定將擴(kuò)增產(chǎn)物BZLF1-BMRF1和重組質(zhì)粒pET32a/BZLF1-BMRF1酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳分析，結(jié)果見(jiàn)圖1，圖2。由圖1可以發(fā)現(xiàn)約在1600bp處的目的條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果相符合；圖2顯示NdeⅠ、Xho雙酶切前有一較亮的質(zhì)粒條帶，質(zhì)粒雙酶切后可以看出約1600bp處目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2融合蛋白Zta-P54誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化對(duì)菌體進(jìn)行溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等表達(dá)條件的優(yōu)化，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。重組的質(zhì)粒經(jīng)不同IPTG濃度誘導(dǎo)，電泳檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，通過(guò)灰度分析，顯示在IPTG濃度為0.2mmol/L時(shí)蛋白表達(dá)量最高，見(jiàn)圖3，圖4。重組的質(zhì)粒在37℃條件下，IPTG濃度為0.2mmol/L時(shí)，改變誘導(dǎo)時(shí)間，經(jīng)電泳檢測(cè)并對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行灰度分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)6h時(shí)蛋白表達(dá)量最高見(jiàn)，圖5，圖6。IPTG濃度為0.2mmol/L時(shí)，通過(guò)改變誘導(dǎo)溫度發(fā)現(xiàn)37℃條件下誘導(dǎo)6h時(shí)蛋白表達(dá)量最高見(jiàn)圖7，圖8。綜上所述，條件優(yōu)化后，最終得到最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為37℃，0.2mmol/LIPTG誘導(dǎo)6h蛋白表達(dá)量最高，蛋白分子量約為60kD，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3融合蛋白的可溶性分析及蛋白純化將重組質(zhì)粒在最佳條件下誘導(dǎo)表達(dá)、收集菌液、離心菌體、破菌、分上清和沉淀電泳分析蛋白可溶性，發(fā)現(xiàn)該蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)（圖9）通過(guò)DEAE-SepharoseCL-6B和Ni-NTA親和層析純化，經(jīng)SDS-PAGE和Photoshop進(jìn)行灰度分析（圖10）。由圖9顯示目的蛋白Zta-P54主要以可溶性的形式存在；經(jīng)SDS-PAGE和Photoshop軟件灰度分析發(fā)現(xiàn)（圖10）通過(guò)DEAE柱純化后Zta-P54蛋白的總灰度為9730，總條帶灰度為12139，計(jì)算得出蛋白純度80%；經(jīng)Ni-NTA親和柱純化后蛋白的總灰度為27435，總條帶灰度為28441，計(jì)算得出蛋白純度96.5%，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定純化后蛋白總量為18mg，即1L菌液可以純化得到18mgZta-P54融合蛋白。

2.4Westernblot結(jié)果分析通過(guò)Westernblot檢測(cè)融合蛋白Zta-P54免疫原性及反應(yīng)特異性，表達(dá)產(chǎn)物Zta-P54為陽(yáng)性對(duì)照，空質(zhì)粒為陰性對(duì)照，加入鼻咽癌患者陽(yáng)性血清反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖11，圖12。由圖11，圖12可知，融合蛋白Zta-P54與鼻咽癌患者陽(yáng)性血清混合反應(yīng)后，在60kD出現(xiàn)特異性反應(yīng)帶；而空載質(zhì)粒pET32a相應(yīng)位置沒(méi)有條帶出現(xiàn)，且可溶性Zta-P54融合蛋白較包涵體Zta-P54融合蛋白有更好的反應(yīng)特異性。

3討論

eb病毒作為一種嗜B淋巴細(xì)胞的人類(lèi)皰疹病毒，它與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、單核細(xì)胞增多癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前廣東地區(qū)鼻咽癌的發(fā)病率較高，且已經(jīng)成為一種較典型的地方性惡性腫瘤疾病，所以鼻咽癌的早期診斷尤為必要，其中用EB病毒抗原檢測(cè)病人血清中的抗EB病毒的抗體用來(lái)篩查鼻咽癌這一疾病的研究備受關(guān)注［9］。目前，隨著分子生物學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有多種EB病毒抗原通過(guò)基因工程表達(dá)和人工合成的方式被純化出來(lái)，并且用作診斷抗原進(jìn)行了ELISA法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等方法的研究［10，11］，這些單個(gè)診斷抗原雖然提高了特異性，但敏感度還不夠。因此，可以應(yīng)用多種EB病毒抗原聯(lián)合檢測(cè)，不但可拓寬了抗體反應(yīng)譜，還可以提高ELISA法的敏感度［12］。目前，張毅等［13］報(bào)道所表達(dá)的EB病毒融合抗原多以包涵體形式表達(dá)。為提高蛋白活性，本研究選擇抗原性較好的立即早期蛋白Zta和早期蛋白P54融合表達(dá)。由于前期研究發(fā)現(xiàn)pGEX5T-BZLF1-BMRF1載體所表達(dá)的Zta-P54蛋白為包涵體［14］，所以更換pET32a作為表達(dá)載體，該載體帶有的Trx標(biāo)簽是高度可溶性多肽，增強(qiáng)了目的蛋白的可溶性。同時(shí)，本研究所選序列引入有一段24bp的連接肽，它編碼的氨基酸為GGGGSGGG，其中甘氨酸沒(méi)有手性碳原子，柔性較好，在融合蛋白之間不會(huì)影響兩邊蛋白各自的構(gòu)象和功能；而絲氨酸是親水性最強(qiáng)的氨基酸，可以提高融合蛋白的親水性。將兩種氨基酸串聯(lián)起來(lái)作為連接肽可以保持兩蛋白原有的生物活性。通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)溫度、時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度等條件，實(shí)現(xiàn)了Zta-P54的可溶性表達(dá)。Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白較包涵體蛋白反應(yīng)特異性性強(qiáng)，克服了包涵體蛋白活性低的缺點(diǎn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在溫度為37℃、誘導(dǎo)時(shí)間6h、IPTG濃度0.2mmol/L的條件下目的蛋白表達(dá)量最高。試驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)該蛋白較易降解，所以純化前用6mol/L尿素處理菌體及飽和硫酸銨沉淀目的蛋白。這一過(guò)程既除去了部分雜蛋白又有效的減緩了融合蛋白Zta-P54的降解。最后，通過(guò)DEAE-SepharoseCL-6B和Ni-NTA親和層析純化，得到純度高達(dá)96.5%的Zta-P54融合蛋白，收率可達(dá)到18mg/L。Westernblot檢測(cè)表明該蛋白可與鼻咽癌患者血清中相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，有良好的免疫原性及反應(yīng)特異性。Zta-P54蛋白是我們表達(dá)的一種全新的兩抗原融合蛋白，將該蛋白應(yīng)用到鼻咽癌早期診斷和篩查中將會(huì)有更好的敏感度和特異性，可降低鼻咽癌的漏診率，且可利用原核表達(dá)方法快速、大量生產(chǎn)該蛋白。

4結(jié)論

本試驗(yàn)成功純化得到可溶性、高純度的融合蛋白Zta-P54，且該蛋白有較好的免疫原性，Zta-P54融合蛋白在EB病毒相關(guān)疾病的診斷上將具有良好的臨床應(yīng)用前景。

作者：王云龍 張春艷 李玉林程蕾王繼創(chuàng)鄧?yán)枥杳缀０讜造o單位：鄭州大學(xué)生物工程系鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院河南省生物工程技術(shù)研究中心