硫酸西索米星氯化鈉注射液的含量測定范文

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摘要:建立硫酸西索米星氯化鈉注射液含量測定的反相高效液相色譜法。色譜柱為AminoglycosideRP18(4.6mm×150mm，3μm)，以庚烷磺酸鈉溶液(取庚烷磺酸鈉6g，加0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液溶解并稀釋至1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至1.5)-乙腈(77∶23)為流動(dòng)相，檢測波長為205nm，流速1.0mL/min，柱溫35℃。西索米星峰與其相關(guān)物質(zhì)及降解產(chǎn)物均分離良好。西索米星在0.010024～1.0024mg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系(Y=4.2102×106X+9.1070×103，r=0.9999，n=7)，檢出限0.6ng(相當(dāng)于0.0001%)，定量限2ng(相當(dāng)于0.0004%)，回收率在99.1%～100.9%(RSD＜1.0%，n=9)。該方法簡便靈敏、重復(fù)性好，能夠用于硫酸西索米星氯化鈉注射液的含量測定。較抗生素微生物檢定法，專屬性更好，縮小了結(jié)果的置信區(qū)間，節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間。

關(guān)鍵詞:反相高效液相色譜法;硫酸西索米星;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);含量測定

西索米星(sisomicin)是20世紀(jì)60年代開發(fā)的由小單孢菌產(chǎn)生的首個(gè)含雙鍵的氨基糖苷類抗生素［1－2］，也是奈替米星的合成用母體［3］，結(jié)構(gòu)與慶大霉素相似，其硫酸鹽制劑在臨床上被廣泛應(yīng)用，具有療效好、價(jià)格較低等特點(diǎn)。國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上顯示，目前我國硫酸西索米星原料有4個(gè)廠家生產(chǎn)，注射液、注射用粉針等不同劑型有32個(gè)生產(chǎn)廠家，原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載入中國藥典、日本藥局方、美國藥典、韓國藥典［4－7］，除《中華人民共和國藥典》采用HPLC-UV法測定原料的含量外，其余均采用抗生素微生物檢定法。硫酸西索米星氯化鈉注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載入《國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)》，采用抗生素微生物檢定法測定含量。抗生素微生物檢定法是一種生物活性測定法，通過測定供試品抗生素抑菌圈的直徑大小，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較，計(jì)算含量，以效價(jià)單位作為計(jì)量單位，缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、影響因素多、誤差較大、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長等;目前美國藥典、日本藥局方和韓國藥典均采用抗生素微生物檢定法控制硫酸西索米星原料藥的含量，僅中國藥典采用HPLC-UV法控制原料藥的含量，但中國藥典的HPLC-UV法主成分與前雜質(zhì)分離不理想。本研究在目前已有各方法的基礎(chǔ)上，建立了一種專屬性更好的反相高效液相色譜法，用于測定硫酸西索米星氯化鈉注射液的含量。新方法簡便靈敏、重復(fù)性好，與抗生素微生物檢定法相比，縮小了結(jié)果的置信區(qū)間，節(jié)省了檢驗(yàn)時(shí)間。

1儀器與試劑

1.1試劑與藥品

庚烷磺酸鈉(HPLC級(jí)，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)，乙腈(HPLC級(jí)，Merck公司)，超純水(Milli-Q儀制備)。其他試劑均為市售，分析級(jí)。硫酸西索米星氯化鈉注射液(江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司，批號(hào):15062303、15090602、15101801);西索米星對(duì)照品(批號(hào):130635-201301，含量56.0%)，奈替米星對(duì)照品(批號(hào):130355-200702)(中國食品藥品檢定研究院)。

1.2儀器

LC-30AD高效液相色譜儀(日本島津公司)：

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用AminoglycosideRP18(4.6mm×150mm，3μm)色譜柱;庚烷磺酸鈉溶液(取庚烷磺酸鈉6g，加0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液溶解并稀釋至1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至1.5)-乙腈(77∶23)為流動(dòng)相:流速1.0mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:205nm;進(jìn)樣量:10μL。

2.2溶液配制

2.2.1系統(tǒng)適用性溶液取西索米星對(duì)照品和奈替米星對(duì)照品各適量，加水溶解并稀釋制成每1mL中約含西索米星0.5mg和奈替米星0.05mg的混合溶液。2.2.2含量測定供試品溶液精密量取硫酸西索米星氯化鈉注射液適量，加水溶解并定量稀釋制成每1mL中約含西索米星0.5mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液。2.2.3含量測定對(duì)照品溶液取硫酸西索米星對(duì)照品，用水溶解制成每1mL中約含西索米星0.5mg的溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

采用“2.2.1”項(xiàng)下溶液進(jìn)行分離度和理論板數(shù)測定，結(jié)果顯示西索米星主峰和前雜質(zhì)分離良好，西索米星與奈替米星分離良好，西索米星峰理論板數(shù)為5860，拖尾因子為0.82。本方法專屬性良好。

2.4破壞試驗(yàn)

取供試品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成每1mL中約含西索米星1.0mg的供試品溶液，分別經(jīng)強(qiáng)酸(1mol/L鹽酸)1mL沸水浴、強(qiáng)堿(1mol/L氫氧化鈉溶液)1mL沸水浴、過氧化氫溶液1mL、水浴90℃加熱30min和紫外光照(λ254nm)24h破壞處理，各液中和后分別用水稀釋成每毫升中約含0.5mg的供試品溶液;取空白溶劑同上進(jìn)行破壞實(shí)驗(yàn)。各取10μL進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果表明:在上述色譜系統(tǒng)下，西索米星色譜峰與各降解產(chǎn)物能良好分離，空白溶劑不干擾主成分的測定(西索米星主成分峰峰純度閾值均＞0.99999，最小峰純度指數(shù)均大于0)。破壞實(shí)驗(yàn)色譜圖見圖2。

2.5檢測限將對(duì)照

品溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣10μL，按S/N=3作為檢測限，記錄色譜圖，定量限濃度約為0.06μg/mL，相對(duì)西索米星供試品溶液濃度水平的0.0001%。

2.6定量限將對(duì)照

品溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣10μL，按S/N=10作為檢測限，記錄色譜圖，定量限濃度約為0.2μg/mL，相對(duì)西索米星供試品溶液濃度水平的0.0004%。

2.7線性范圍

取西索米星對(duì)照品，加水溶解并稀釋制成1.0024、0.80052、0.5012、0.20013、0.10024、0.050033、0.010024mg/mL的溶液，分別量取10μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以濃度(X)和峰面積(Y)作線性回歸，得回歸方程為:Y=4.2102×106X+9.1070×103(r=0.9999，n=7)。西索米星濃度在0.010024～1.0024mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。選擇0.5mg/mL作為供試品測定濃度，即在供試品濃度的2%～200%范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8精密度

按“2.2.3”項(xiàng)下配制西索米星對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算主峰面積的RSD為0.09%，保留時(shí)間的RSD為0.11%，表明該方法精密度良好。

2.9重復(fù)性

取批號(hào)為15062303的樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下條件處理得供試品溶液。分別取10μL注入液相色譜儀測定含量，結(jié)果的RSD為0.76%，保留時(shí)間的RSD為0.19%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.10溶液穩(wěn)定性

取批號(hào)為15062303的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下條件處理得供試品溶液，分別置在0、2、4、6和8h后測定，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果主峰面積的RSD為0.33%，保留時(shí)間的RSD為0.13%，表明西索米星供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11回收率

試驗(yàn)精密稱取西索米星對(duì)照品，按處方配制樣品溶液，用水稀釋制成測定濃度的80%、100%、120%的溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確度良好。

2.12方法的耐用性

采用3種品牌的耐酸色譜柱進(jìn)樣系統(tǒng)適用性溶液，考察方法的耐用性，結(jié)果前雜質(zhì)峰與西索米星峰、西索米星與奈替米星峰均可以達(dá)到較為理想的分離，耐用性較好(見表2)。采用ThermoAminoglycoside(4.6mm×150mm，3μm)色譜柱，略微改變“2.1”項(xiàng)下色譜條件的參數(shù):柱溫(32℃、35℃、38℃)，流速(0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min)，流動(dòng)相pH(pH1.4、pH1.5、pH1.6)分別進(jìn)樣。系統(tǒng)適用性各峰分離良好，方法的耐用性良好。

2.13含量測定

取硫酸西索米星氯化鈉注射液，按“2.2.2”項(xiàng)下處理得供試品溶液，同法配制對(duì)照品溶液。分別精密量取供試品溶液和照品溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖;按外標(biāo)法計(jì)算西索米星的含量，并與抗生素微生物檢定法進(jìn)行比較。結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，兩種方法的含量測定結(jié)果無顯著性差異。但從實(shí)驗(yàn)時(shí)間、成本以及誤差范圍綜合考量，HPLC-UV方法有更大優(yōu)勢。

3討論

3.1方法的優(yōu)化

《中華人民共和國藥典》(2015年版)硫酸西索米星原料含量測定方法與USP40奈替米星含量測定方法色譜條件相同，均采用C18色譜柱，以庚烷磺酸鈉溶液(取庚烷磺酸鈉20.22g，加0.07mol/L的磷酸溶液溶解并稀釋至1000mL)-乙腈(62∶38)為流動(dòng)相。在該色譜條件下，西索米星峰難以與其前相鄰雜質(zhì)峰良好分離，且流動(dòng)相離子對(duì)試劑濃度偏高，需較長的平衡時(shí)間。本文在中國藥典方法基礎(chǔ)上，降低流動(dòng)相中庚烷磺酸鈉的濃度(由2%至0.6%)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至1.5，優(yōu)化后的色譜條件下西索米星峰與前相鄰雜質(zhì)峰以及西索米星峰與奈替米星峰均能達(dá)到良好的分離效果。

3.2本文方法與抗生素微生物檢定法的比較

抗生素微生物檢定法可直觀反映藥品的抗菌活性，與臨床應(yīng)用的要求相符，能確定抗生素的醫(yī)療應(yīng)用潛質(zhì)，但該方法專屬性較差，凡具有抗菌活性的物質(zhì)都會(huì)干擾測定結(jié)果，且耗時(shí)長，對(duì)操作人員要求高且易產(chǎn)生諸多操作誤差，重復(fù)性及精密度均較低。反相高效液相色譜法能使制劑中的組分與輔料有效分離，雜質(zhì)及輔料對(duì)測定結(jié)果無干擾，靈敏度高，操作簡單、快速，結(jié)果準(zhǔn)確。本研究方法優(yōu)化了中國藥典所用HPLC方法的條件，提高了分離能力，大大降低了檢驗(yàn)成本，同時(shí)滿足了較高的精密度和準(zhǔn)確度。本研究方法的測定結(jié)果與抗生素微生物檢定法測定結(jié)果間沒有顯著差異，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間、成本和置信區(qū)間等方面，HPLC-UV法具有更大的優(yōu)勢。致謝:趙述強(qiáng)，張如夢同志收集整理相關(guān)資料并對(duì)研究工作給予幫助。

作者：侯玉榮 范青峰 史孫亮 袁耀佐 張玫 單位：江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院