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《食品與藥品雜志》2014年第三期
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)取材灌胃5周后,經(jīng)腹腔注射25%烏拉坦(4mL/kg)麻醉,用碘酒、乙醇消毒膝關(guān)節(jié)后,從髕上囊部位注射1mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)進(jìn)入關(guān)節(jié)腔,反復(fù)活動(dòng)關(guān)節(jié)后,抽取灌洗液,做好標(biāo)記置入-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫辉跓o(wú)菌條件下切開(kāi)關(guān)節(jié)腔,取出關(guān)節(jié)并固定于10%甲醛固定液保存以備用。
1.2指標(biāo)觀察
1.2.1新西蘭兔的生活狀態(tài)每天觀察動(dòng)物生活狀態(tài),每周稱(chēng)量各組體重,繪制生長(zhǎng)曲線,觀察動(dòng)物傷口愈合情況。1.4.2股骨髁標(biāo)本的大體觀察肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨缺損部位的修復(fù)情況。
1.2.3病理組織學(xué)觀察用10%中性甲醛固定關(guān)節(jié)軟骨后,常規(guī)脫鈣、沖洗、脫水、包埋和切片,HE染色。光鏡下觀察病理組織學(xué)切片。
1.2.4灌洗液中的炎性因子檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α的水平。按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。
1.3統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)均用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1實(shí)驗(yàn)用兔生長(zhǎng)情況實(shí)驗(yàn)用兔的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。造模后傷口愈合較好,未出現(xiàn)發(fā)炎感染等情況,觀察造模部位,無(wú)紅腫,無(wú)炎性滲出,精神狀態(tài)良好。對(duì)照組5周內(nèi)生長(zhǎng)較平穩(wěn),其余幾組造模后體重均明顯下降,模型組下降最明顯。
2.2軟骨修復(fù)情況模型組、低分子量CS組與高分子量CS組結(jié)構(gòu)均良好,缺陷孔徑變小。然而低分子量CS組與模型組和高分子量CS相比,其軟骨表面較平整,凹陷基本填充,肉眼可見(jiàn)缺陷處有乳白色透明或半透明膜樣組織,顏色與正常軟骨相近,觸之較硬,質(zhì)量較好。模型組與高分子量CS組中肉眼清晰可見(jiàn)股骨內(nèi)髁滑車(chē)面上有凹陷,軟骨表面不平滑與周?chē)\浌墙缦耷宄伾c周?chē)浌窍嘟M瑫r(shí),其修復(fù)組織填充較慢。模型組、低分子量CS組、高分子量CS組與對(duì)照組比較,其軟骨表面與正常軟骨表面仍有一定界限。
2.3病理組織學(xué)觀察見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),經(jīng)HE染色,損傷修復(fù)處可見(jiàn)初期修復(fù)反應(yīng)。模型組與給予CS組,其缺損處與對(duì)照組相比都有不同程度修復(fù)。但模型組修復(fù)程度較差,缺損處填充的多是纖維組織和肉芽組織,軟骨細(xì)胞較少,且排列較紊亂。給予CS組,損傷處被少量死骨,增生的成骨細(xì)胞及纖維組織填充,而且給予低分子量的CS組表面有增生的骨膜組織生成,表面軟骨細(xì)胞平行排列,底部可見(jiàn)新生骨小梁。相比之下高分子量CS組損傷處軟骨細(xì)胞和纖維組織填充較少,且無(wú)骨膜形成。
2.4關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量由表1可見(jiàn),低分子量CS組與高分子量CS組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量均低于模型組(P<0.05),且低分子量CS組中各指標(biāo)均優(yōu)于高分子量CS(P<0.05),有的指標(biāo)甚至接近對(duì)照組。但高低劑量之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
3討論
硫酸軟骨素的分子結(jié)構(gòu)主要由D-葡糖醛酸與N-乙酰半乳糖胺組成,相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為1.0×104~5.0×104。硫酸軟骨素的功能主要是通過(guò)組成的蛋白聚糖體現(xiàn),大致可分為結(jié)構(gòu)功能和調(diào)節(jié)功能兩類(lèi)。CS具有一定的親骨性,可進(jìn)入軟骨組織,利于提高透明質(zhì)酸含量,從而維持關(guān)節(jié)腔內(nèi)透明質(zhì)酸水平,促進(jìn)結(jié)構(gòu)蛋白合成和加強(qiáng)降低軟骨面退變,使軟骨得到較好的保護(hù)。雖然CS生物活性較高,但它在細(xì)胞轉(zhuǎn)移、分化、增殖、識(shí)別以及組織形式等生物過(guò)程中都起到了重要作用。但傳統(tǒng)CSMr較高,不易透過(guò)細(xì)胞膜,臨床應(yīng)用中主要面臨生物利用率低的問(wèn)題。近年研究證明,Mr為3500~5300的硫酸軟骨素,其藥理活性最強(qiáng),對(duì)防治風(fēng)濕性炎癥以及傷口愈合等具有更好的治療效果[7]。
研究表明,造模孔徑小于3mm,深度不夠,不能造成軟骨缺失,且缺失部位可在造模6周后部分或全部修復(fù)。很難證明,關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)與藥物有關(guān)。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)新西蘭兔右膝股骨內(nèi)髁滑車(chē)面鉆孔,鉆出3mm×3mm孔徑,造成關(guān)節(jié)軟骨缺失。選用低分子量CS與高分子量CS給藥,觀察其治療及修復(fù)結(jié)果,比較其不同。結(jié)果表明,CS對(duì)于軟骨的修復(fù)有較好的療效,低分子量CS與高分子量CS相比,其效果明顯,這可能是因低分子量CS分子量較小,機(jī)體容易吸收,提高了機(jī)體對(duì)CS的生物利用率。因此,低分子量CS對(duì)軟骨具有較好的修復(fù)作用。IL-1β可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶基因mRNA的表達(dá),降解軟骨基質(zhì);而TNF-α屬于介導(dǎo)軟骨損傷的炎癥細(xì)胞因子,能選擇性地抑制軟骨膠原產(chǎn)生,同時(shí)可抑制蛋白聚糖合成;且TNF-α和IL-1β均可導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解。本研究結(jié)果表明,給予低分子量CS的組別,其關(guān)節(jié)液中的IL-1β、TNF-α含量低于高分子量CS和模型組,表明低分子量CS在軟骨修復(fù)過(guò)程中降低IL-1β和TNF-α效果好于高分子量CS。軟骨修復(fù)也可能是通過(guò)影響這些因子,達(dá)到了較好的療效。目前對(duì)CS的研究主要集中在高分子量,對(duì)低分子量CS的研究較少。本實(shí)驗(yàn)探討低分子量CS對(duì)軟骨的修復(fù)作用,觀察評(píng)價(jià)其修復(fù)與愈合情況。為以后研究和應(yīng)用低分子量CS提供一定的依據(jù)。
作者:裴彤劉占濤袁洵劉坤高華單位:青島大學(xué)藥學(xué)院