硫酸黏菌素穩定性探討范文

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《中國抗生素雜志》2016年第二期

摘要：

本文研究了硫酸黏菌素溶液在不同pH、溫度、攪拌速度下的穩定性。結果表明硫酸黏菌素對pH的變化較為敏感，在pH6時較為穩定，在強堿環境下，pH越高，處理時間越長硫酸黏菌素的穩定性越差。升高溫度和攪拌速度的變化不會破壞其結構。

關鍵詞：

硫酸黏菌素；穩定性；效價

硫酸黏菌素，別名抗敵素、克里斯汀。對大多數的革蘭陰性桿菌有較強的抗菌作用，對銅綠假單胞菌的作用最為顯著，對大腸埃希菌、沙門菌、痢疾桿菌、流感桿菌、百日咳桿菌等也有良好的作用。從結構上來說，硫酸黏菌素是一種堿性多肽類抗生素，擁有七肽環和三肽尾[1-2]，結構如圖1所示。當前制藥行業主要采用離子交換法分離提取硫酸黏菌素，生產過程耗水量大，同時產生大量的廢水，工藝時間長。在當前國內環保壓力日趨加大的情況下，工藝革新迫在眉睫。對其穩定性的深入認識是工藝革新的重要基礎數據。然而文獻中圍繞硫酸黏菌素的研究大多集中在藥物制劑[3]、分析方法[4]、養殖業應用[3-6]、菌種選育與發酵工藝研究等方面[7-9]，進行穩定性研究報道極少，只有陳勇等[10]研究了硫酸黏菌素在30℃未酸化發酵液、酸化濾液、離子交換解析液及濃縮液中硫酸黏菌素的穩定性，但是如果要想對硫酸黏菌素的提取工藝進行革命性的變革，仍需對硫酸黏菌素在各種條件下的穩定性進行廣泛而深入的研究。而這恰是本論文研究的出發點。

1材料與方法

1.1材料與儀器硫酸黏菌素符合歐洲藥典標準，產品由河北圣雪大成制藥有限責任公司提供，硫酸黏菌素標準品由北京中科儀友化工技術研究院提供。氫氧化鈉、硫酸、磷酸均為分析純，天津市大茂化學試劑廠；無水硫酸鈉為分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；水為實驗室自制去離子水。AR1140型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；高效液相色譜儀,南京普惠生物技術有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1硫酸黏菌素溶液的配制取15g硫酸黏菌素，加入一定量去離子水后攪拌使其溶解，同時控制攪拌的轉速，以防產生大量的泡沫。用去離子水定容至1.5L制成1%的溶液，用pH計測得初始溶液的pH為6.72。

1.2.2硫酸黏菌素效價的測定采用高效液相色譜儀進行純度分析。色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)。色譜條件如下，流速為1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長為215nm，進樣體積20μL。將4.46g無水硫酸鈉溶解到900mL水中，加入2.5mL磷酸，然后用水稀釋到1000mL，即試液A。按照體積比試液A：乙腈=78:22制成流動相[11-13]。精密稱取硫酸黏菌素對照品25mg，用0.05mol/L硫酸稀釋到50mL，制成標準液。精密稱取硫酸黏菌素檢品試樣，用0.05mol/L硫酸稀釋成約10000U/mL的溶液，搖勻既得檢測液。將上述兩溶液分別用孔徑0.22μm的水系微孔濾膜濾過，貯存于小容器中。待系統平衡后，注入標準液，當連續3針黏菌素E1和E2峰面積和的變異系數(RSD)在2%以內，注入檢測液，實驗中每一測試樣均進3針，取其平均值。實驗中最大變異系數(RSD)為0.62%，說明影響因素相對較少，數據可靠。

1.2.3硫酸黏菌素溶液在不同溶液pH的條件調節恒溫加熱磁力攪拌器轉速300r/min，溫度為30℃。取100mL配好的濃度為1%的硫酸黏菌素溶液，用1mol/L的硫酸和1mol/L的氫氧化鈉調節pH為2~9，攪拌30min后，采用HPLC法測定效價。在相應的條件下重復試驗3次，當變異系數(RSD)在2%以內時取其平均值為最終的實驗數據。

1.2.4硫酸黏菌素溶液在不同溶液溫度的條件取100mL配好的上述溶液，調節恒溫加熱磁力攪拌器轉速300r/min。調節溫度為30~80℃，分別攪拌30min后采用HPLC法測不同溫度下硫酸黏菌素的效價。在相應的條件下重復試驗3次，當變異系數(RSD)在2%以內時取其平均值為最終的實驗數據。

1.2.5硫酸黏菌素溶液在堿性條件下隨時間變化的條件分別取300mL配好的上述溶液于兩個燒杯中，用1mol/L的氫氧化鈉調pH為12和11。控制溶液溫度為30℃，每半小時取一次樣，用HPLC法檢測硫酸黏菌素在堿性條件下隨時間變化的效價。在相應的條件下重復試驗3次，當變異系數(RSD)在2%以內時取其平均值為最終的實驗數據。

1.2.6硫酸黏菌素溶液在不同攪拌速度下量取上述配好的溶液100mL，調節恒溫磁力攪拌器的溫度為30℃，調節轉速為100r/min，攪拌30min，測該攪拌速度下的效價。調節轉速為200、300、400、500和600r/min，攪拌30min，測該攪拌速度下的效價。在相應的條件下重復試驗3次，當變異系數(RSD)在2%以內時取其平均值為最終的實驗數據。

2結果與分析

2.1pH的變化對硫酸黏菌素穩定性的影響pH的變化對硫酸黏菌素的穩定性試驗結果見圖2。由圖2可知，硫酸黏菌素在pH為6附近效價最高，隨著pH的降低，效價逐漸降低，從pH6到pH2效價降低了4%，效價降低的較為平緩。隨著溶液pH的升高，從pH6到pH8效價降低了2.04%，而隨著pH進一步升高，效價急劇降低。總體上在pH2到pH8范圍內效價變化相對平緩，說明在水溶液中硫酸黏菌素發生電離平衡，即硫酸黏菌素的離子濃度和pH之間存在平衡關系。pH的變化直接影響了溶液和固形物之間的吸附平衡。當pH大于8時效價急劇降低，主要原因是堿性增強，硫酸黏菌素會轉變成相應的堿，而黏菌素堿在水溶液中溶解度較低而沉淀析出，此外在強堿性條件下硫酸黏菌素的穩定性較差，對硫酸黏菌素的高級結構和空間結構破壞性較強。這些因素都會對硫酸黏菌素在水溶液中的穩定性產生影響。

2.2溫度的變化對硫酸黏菌素穩定性的影響溫度的變化對硫酸黏菌素的穩定性試驗結果見圖3。從圖中可以發現：隨著溫度的升高效價穩步升高，由30℃時的246000U/mL升高到80℃的271000U/mL。效價升高了9.22%，主要原因是硫酸黏菌素在水溶液中存在電離平衡，溫度的變化會對電離平衡產生影響，溫度升高其電離程度加大。推斷可能是其極性疏水性發生改變引起了空間結構變化。利用硫酸黏菌素在高溫條件下的性質，可以采用熱絮凝的方式進行發酵液的前處理，從而去除一部分的雜質蛋白，有利于提高過濾速度和產品質量。

2.3硫酸黏菌素在堿性條件下隨時間變化的穩定性時間的變化對硫酸黏菌素的穩定性試驗結果見圖4。由于沉淀法提取硫酸黏菌素常需要在較高的pH下使硫酸黏菌素沉淀，因此在強堿條件下硫酸黏菌素的穩定性將直接影響產品的收率和質量。本實驗選取了pH11和pH12兩個強堿性環境，從圖中可以看出隨著時間的推移，無論pH11或pH12硫酸黏菌素的效價逐漸降低，說明對同一pH下，時間越長硫酸黏菌素穩定性越差，破壞的越嚴重。在1.5h以內兩條曲線的下降趨勢基本相同，但1.5h以后，在pH為12的溶液效價開始迅速下降而pH11的溶液下降較為平緩。5h內pH11的溶液效價損失11%，pH12的溶液效價損失16.97%，說明堿性越強對黏桿的破壞越嚴重。在不影響沉淀效果的前提下，應選擇相對較低的pH。

2.4攪拌速度對黏菌素穩定性的影響攪拌速度對硫酸黏菌素的穩定性試驗結果見圖5。從圖中可以看出隨著攪拌速度的增加，效價的變化并不劇烈，最低在236000U/mL，最高在238000U/mL。基本維持在一個穩定的區間里。因此攪拌速度對硫酸黏桿菌素的穩定性影響不大，并不會破壞硫酸黏菌素的結構。

3結果與討論

pH會對硫酸黏菌素的穩定性產生影響。過酸和過堿都會破壞硫酸黏菌素的穩定性。堿性條件下硫酸黏菌素的高級結構和空間結構破壞程度更大。在pH6時穩定性較好。在一定溫度范圍內溫度升高，有利于提高效價。對同一pH下，時間越長硫酸黏菌素的結構破壞的越嚴重，穩定性越差。堿性越強對硫酸黏菌素的破壞越嚴重，穩定性越差。攪拌速度并不會破壞硫酸黏菌素的結構，不會對硫酸黏菌素的穩定性產生明顯的影響。

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作者：楊立國 趙金芳 劉俊果 單位：河北科技大學生物科學與工程學院