硫酸阿米卡星的藥代動力學(xué)范文

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《畜牧與獸醫(yī)雜志》2014年第六期

1材料與方法

1.1試劑及溶液硫酸阿米卡星注射液來自于上海恒豐強動物藥業(yè)有限公司，批號為20121101;甲醇、乙腈(CNW公司)為色譜純;有機相針式濾器(0.45μm，CNW公司);WhatmanNo.4濾紙、GF/C玻璃纖維濾紙(上海利根商貿(mào)有限公司);進樣瓶(CNW公司)。四硼酸二鈉緩沖劑:3.8g四硼酸二鈉溶于80mL蒸餾水中，用NaOH調(diào)pH至10.38后定容至100mL棕色容量瓶中，使用前用0.45μm的有機相針式濾器過濾。衍生化試劑:精密稱取OPA120mg，溶解于3mL甲醇中，加入15mL0.1mol•L－1的四硼酸二鈉溶液，加入150μL2－巰基乙醇，混勻，試劑室溫、暗處過夜處理，使用前過濾。阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精密稱取阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品1mg，加入1mL的水溶解混勻、過濾，配制為1mg•mL－1的阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)儲備液。磷酸二氫鈉流動相的配制:精密稱取磷酸二氫鈉7.80g，溶于800mL水中，用硼酸調(diào)pH至3.67后定容至1000mL的容量瓶中。使用前用真空抽濾機將溶液過濾，超聲脫氣備用。

1.2色譜條件色譜柱:inertsilODS－3V(5μm，4.6×150mm);保護柱;流動相:甲醇:0.05mol•L－1磷酸二氫鈉(pH=3.67)(體積70∶30);熒光檢測波長:激發(fā)波長342nm，發(fā)射波長440nm;流速1.0mL•min－1;柱溫:40℃。

1.3衍生反應(yīng)阿米卡星在0.5～50μg•mL－1的濃度范圍內(nèi)，通過測定不同OPA衍生劑的量、衍生時間對阿米卡星的影響，確定阿米卡星衍生的最佳條件。取阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋后的溶液200μL于進樣瓶中，加入OPA衍生劑200μL，具塞震蕩混勻1min后取20μL進樣。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)儲備液依次稀釋為0.5、1、2、5、8及20μg•mL－1這一系列濃度的溶液，取各個濃度的溶液200μL，按1.4的條件衍生后，取20μL進樣檢測，并且重復(fù)3次取平均值。以阿米卡星的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并作回歸分析，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5檢測限與定量限檢測限是反映分析方法整體的靈敏度的指標(biāo)，是從樣品背景信號中檢測出待測物質(zhì)存在時所需的最低濃度;定量限是樣品中待測物質(zhì)能夠被定量測定的最低量，結(jié)果具有準(zhǔn)確度和精確性。配制不同濃度阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品溶液，添加到空白血漿中，按血漿樣品凈化的方法提取凈化，HPLC分析。以信噪比3∶1作為檢測限，以信噪比10∶1作為定量限。

1.6精密度與回收率精密量取適量空白血漿樣品，按照阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，分別配制含阿米卡星低、中、高(1、5及10μg•mL－1)三個濃度的血漿樣品，每個濃度按血漿樣品預(yù)處理方法處理后，重復(fù)進樣5次，取平均值計算提取回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和日內(nèi)變異系數(shù)，同時每份樣品1周內(nèi)連續(xù)測定5d，計算日間變異系數(shù)。

1.7血液樣品的凈化取保存于－20℃冰箱內(nèi)的血漿樣品，溶解回溫后精密量取血漿樣品200μL于離心管內(nèi)，加入pH10.38的四硼酸二鈉緩沖液200μL，漩渦混合后，加入乙腈400μL，漩渦震蕩1min，1200r•min－1離心10min，取上清液200μL待用。

1.8給藥和采樣選擇健康成年混血犬8只，體重約為10kg，并在試驗前，所有犬只至少飼養(yǎng)7d，且在試驗前沒有使用過任何會影響阿米卡星代謝的藥物，整個試驗期間，嚴(yán)密觀察各犬的精神狀態(tài)和臨床反應(yīng)，包括食欲、飲欲、大小便情況以及可能出現(xiàn)的胃腸道等方面的不良反應(yīng)。試驗時，稱重后，皮下注射硫酸阿米卡星，給藥劑量為10mg•kg－1，于給藥前0.5h，給藥后5、10、15及30min和1、2、4、8、12、24、48、72及96h頸靜脈采血，所有樣品采血后離心，取血漿，進行藥代動力學(xué)測定。

1.9血－藥濃度數(shù)據(jù)的處理根據(jù)血漿藥物濃度－時間數(shù)據(jù)，做藥時曲線圖，藥時曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖均采用Excel軟件繪制。運用SPSS18.0軟件中進行統(tǒng)計分析和中國藥理學(xué)會編制的3P97軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)，并給出最可能的房室模型，統(tǒng)計值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2結(jié)果

2.1阿米卡星的色譜按照1.3的色譜條件，所得空白血漿、阿米卡星血漿樣品、阿米卡星血漿樣品加標(biāo)色譜見圖1－圖3。結(jié)果表明:高效液相色譜法基線走勢平穩(wěn)，阿米卡星出峰時間大約為10.046min，其中血液樣品經(jīng)過凈化后，雜峰較少，雜峰目標(biāo)峰分離較好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不會干擾主峰阿米卡星的分離。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線以峰面積為縱坐標(biāo)，以待測樣品的濃度為橫坐標(biāo)，以加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，所得阿米卡星溶液濃度在0.5～100μg•mL－1之間，線性關(guān)系良好，回歸方程為y=10008x+24570，相關(guān)系數(shù)R2=0.997，阿米卡星的定量限0.5μg•mL－1，最低檢測濃度達(dá)到0.2μg•mL－1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。2.3阿米卡星精密度和提取回收率的測定當(dāng)血漿樣品中添加的阿米卡星的濃度分別為1、5及10μg•mL－1時，其提取回收率(n

=5)分別為(91.41±8.78)%、(93.56±6.16)%及(95.58±4.81)%。結(jié)果表明:本試驗條件下所用方法的精密度符合要求，測定方法可靠。當(dāng)血漿樣品中添加的阿米卡星的濃度分別為1、5及10μg•mL－1時，其日內(nèi)變系數(shù)(n=5)分別為6.68%、5.54%及5.24%，日間變異系數(shù)(n=5)分別為7.36%、5.94%及5.64%。結(jié)果表明:本試驗條件下所用方法的精密度符合要求，測定方法可靠。

2.4阿米卡星在犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征各組犬按10mg•kg－1單劑量皮下注射阿米卡星后，將不同的時間點所得血漿樣品經(jīng)過處理后進行分析，所得血藥濃度變化見下表。根據(jù)血漿藥物濃度時間數(shù)據(jù)，采用Excel軟件繪制藥－時曲線，見圖6。由結(jié)果可知，血漿中阿米卡星濃度的達(dá)峰時間為給藥后0.5～1h，阿米卡星的血藥濃度在給藥后2h后開始下降。

2.5犬單劑量皮下注射阿米卡星后的主要藥代動力學(xué)參數(shù)采用中國藥理學(xué)會編3P97軟件將上述實測所得的藥時濃度數(shù)據(jù)進行處理，行擬合優(yōu)度值(odness－of－fitvalue)比較，利用AIC最小值原則結(jié)合F檢驗法得出最佳房室模型。通過比較發(fā)現(xiàn)，犬單劑量皮下組織阿米卡星在犬體內(nèi)的代謝過程符合一級吸收二室開放的藥代動力學(xué)模型，其中權(quán)重系數(shù)為1/C。同時運用梯形面積法計算并得到A、Tmax、AUC、Cmax等主要藥動學(xué)參數(shù)，具體見表1。在本試驗的條件下，犬在10mg•kg－1單劑量皮下注射阿米卡星之后的藥物濃度達(dá)峰時間(Tmax)為(0.886±0.06)h，峰濃度(Cmax)為(31.35±1.41)μg•mL－1，血漿中阿米卡星的T1/2β(消除半衰期)為(1.779±0.13)h，這表明阿米卡星為短效消除藥物;阿米卡星的藥時曲線下面積(AUC)為(104.9±8.46)μg•h•mL－1，這表明阿米卡星在犬體內(nèi)分布廣泛，代謝、消除時間短。本試驗所選用的測定血漿內(nèi)的阿米卡星濃度的高校液相分析方法能滿足對阿米卡星的臨床效果的評價要求，具有準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。

3討論

阿米卡星是卡那霉素A在C－1的氨基上引入α－羥基－γ－氨基丁酸得到的，其具有極性強、水溶性大和無揮發(fā)性等特點，且缺少紫外吸收基團，因此采用紫外檢測具有一定的難度。但阿米卡星在結(jié)構(gòu)上具有活潑基團(氨基)，因此可以利用這個特征，使阿米卡星與衍生化試劑進行反應(yīng)而成在紫外區(qū)間有吸收或有熒光的物質(zhì)，即可利用紫外或熒光進行檢測。阿米卡星在有2－巰基乙醇存在、pH為9～11的條件下，伯胺基化合物可作為親核試劑與OPA發(fā)生反應(yīng)生成1－硫代－2－烷基異吲哚，試劑過量2～3個數(shù)量級的情況下可在數(shù)秒內(nèi)完成，且過量的衍生化試劑不影響HPLC的測定結(jié)果。由于OPA衍生化試劑信號很快衰減，故本試驗采用柱前衍生法進行衍生。去除血漿中蛋白的方法有無水乙醇沉淀法、磺基水楊酸沉淀法、乙腈沉淀法和三氯乙酸沉淀法等。由于OPA衍生時的最佳pH值為10.4，而水楊酸和磺基乙酸沉淀法會改變血液樣品的pH值從而會影響衍生程度，因此參考相關(guān)文獻(xiàn)，在血液樣本的處理上采用乙腈沉淀蛋白時血漿與乙腈的體積比為1∶2時即能除去95%的蛋白質(zhì)，故在試驗中采用了乙腈沉淀法。

在衍生反應(yīng)條件的優(yōu)化上主要考察了濃度一定的情況下，OPA的體積對反應(yīng)程度的影響，結(jié)果表明OPA衍生劑與阿米卡星進行衍生反應(yīng)的最適濃度為1∶1(V/V)。皮下注射硫酸阿米卡星后，盡管跟相關(guān)參考文獻(xiàn)的給藥劑量相同，但T1/2α和T1/2β均大于文獻(xiàn)報道的小獵犬(分別為0.472h和1.193h)和灰狗(分別為0.476h和1.220h)的，V/F比小獵犬(0.229L•kg－1)和灰狗(0.241h)的小，這表明犬皮下注射硫酸阿米卡星后吸收完全且較迅速，消除較緩慢。本試驗中Tmax和Cmax均比小獵犬(分別為0.671h和25.86μg•mL－1)和灰狗(分別為0.640h和27.40μg•mL－1)的大，說明硫酸阿米卡星在混血犬體內(nèi)經(jīng)皮下注射后其達(dá)峰時間比小獵犬和灰狗長，但峰濃度高。硫酸阿米卡星在動物體內(nèi)的代謝與動物品種有關(guān)，即藥代動力學(xué)特征差異大。也有文獻(xiàn)顯示同樣品種不同給藥途徑，硫酸阿米卡星在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)也會出現(xiàn)明顯差異。因此在獸醫(yī)臨床用藥中應(yīng)根據(jù)不同動物、不同品種的具體藥代動力學(xué)特征、甚至對具體的給藥方式也需要進行評估來制定給藥方案，從而避免產(chǎn)生毒副作用。

作者：唐龍琴周闖孫一涵張海彬單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院