肺炎球菌結(jié)合疫苗中的鋁含量測(cè)定范文

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《藥物分析雜志》2015年第十一期

肺炎鏈球菌在呼吸道的感染可以引起支氣管炎、肺炎、中耳炎、鼻竇炎等疾病，如果肺炎鏈球菌侵入血液則會(huì)引起腦膜炎、敗血癥等更為嚴(yán)重的疾病［1－2］。肺炎鏈球菌始終是導(dǎo)致兒童腦膜炎、菌血癥、肺炎等嚴(yán)重疾病的首位病原菌，是引起鼻竇炎和急性中耳炎的最常見病因，也是出生20d后小兒社區(qū)獲得性肺炎首位細(xì)菌病原。全球疫苗和免疫聯(lián)盟(GAVI)研究估計(jì)了全球小于5歲兒童肺炎鏈球菌的疾病負(fù)擔(dān)，其中中國每年有174萬兒童感染肺炎鏈球菌，占全球病例總數(shù)12%。有效安全的疫苗免疫接種是預(yù)防肺炎鏈球菌感染的有效措施，以莢膜多糖為抗原成分的多糖疫苗在2歲以下嬰幼兒中免疫效果不理想，即使在成人中也僅能產(chǎn)生短期、中等強(qiáng)度的保護(hù)作用。研究證明將多糖與蛋白載體共價(jià)偶聯(lián)形成結(jié)合疫苗，可使多糖由T細(xì)胞非依賴性抗原轉(zhuǎn)化為T細(xì)胞依賴性抗原，增強(qiáng)多糖的免疫原性，使嬰幼兒產(chǎn)生足夠的保護(hù)力［8］。已經(jīng)上市的7價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗和國內(nèi)外均在研究開發(fā)13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗，磷酸鋁/氫氧化鋁作為佐劑，能夠延長(zhǎng)多糖蛋白結(jié)合抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，引起炎癥反應(yīng)，刺激淋巴細(xì)胞增殖分化，提高免疫效果［9］。目前可用于鋁含量測(cè)定的方法主要有電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(induc-tivelycoupledplasmaopticalemissionspectrometry，ICP－OES)法、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICPmassspectrometry，ICP－MS)法和化學(xué)滴定法等。目前肺炎球菌結(jié)合疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中鋁含量的測(cè)定均采用化學(xué)滴定法(中國藥典2010年版三部)，但是該方法靈敏度低，樣品消耗量大，測(cè)定鋁含量的樣品單次用量需10mL(20支樣品)，并且此方法以肉眼判斷終點(diǎn)，人為誤差較大。ICP－OES法利用鋁元素發(fā)出的特征譜線進(jìn)行樣品中鋁含量的測(cè)定，具有靈敏度高、干擾性小、樣品用量小(僅為2mL)等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)參照中國藥典2010年版一部及相關(guān)文獻(xiàn)，建立了ICP－OES測(cè)定13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗中鋁含量的檢測(cè)方法，將微波消解法和0．1mol•L－1鹽酸直接處理法進(jìn)行初步比較，選擇簡(jiǎn)便的0．1mol•L－1鹽酸直接處理法預(yù)處理樣品從線性、重復(fù)性、加樣回收率、專屬性以及溶液穩(wěn)定性等多方面進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，確保方法準(zhǔn)確有效可重復(fù)，為鋁含量檢測(cè)方法的改進(jìn)打下基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

1．1儀器電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Thermofisherscientific，Icap6300)購自美國賽默飛世爾公司;微波消解儀購自意大利麥爾斯通公司。

1．2試藥未上市的13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗由某企業(yè)提供;鋁單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB04－1713－2004)，質(zhì)量濃度為1000μg•mL－1，批號(hào)11708，購自中國計(jì)量科學(xué)研究院;硝酸(微電子級(jí)化學(xué)品，超凈高純?cè)噭?;30%過氧化氫(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;濃鹽酸(分析純)購自ThermoFisher公司。

2方法與結(jié)果

2．1方法學(xué)的建立

2．1．1儀器工作條件入射功率:1．15kW;冷卻氣:氬氣;冷卻氣流量:12L•min－1;載氣流量:1L•min－1;輔助氣流量:0．7L•min－1;樣品提升量:1mL•min－1;檢測(cè)波長(zhǎng):308．215nm。

2．1．2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備分別精密量取鋁單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液5、25、50、75、100μL于不同的50mL量瓶中，用1．3%硝酸溶液稀釋并定容至刻度，混勻，得1、5、10、15、20μg•mL－1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2．1．3樣品預(yù)處理方法的選擇0．1mol•L－1鹽酸稀釋處理樣品:精密量取樣品2mL于50mL量瓶中，用0．1mol•L－1鹽酸稀釋并定容至刻度，充分混勻，分析前在室溫下至少放置24h，即得供試品溶液;微波消解處理樣品:精密量取樣品2mL于消解瓶中，分別加入濃硝酸2mL，30%過氧化氫1mL，置微波消解儀中密封消解35min;待消解液冷卻后，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，每份樣品瓶中加入濃硝酸1mL，并用新制超純水定容至刻度，即得供試品溶液。每種預(yù)處理方法平行制備2份供試品溶液，每份溶液連續(xù)進(jìn)樣3次，結(jié)果ICP－OES法測(cè)得0．1mol•L－1鹽酸預(yù)處理后的樣品鋁含量均值為241．125μg•mL－1，RSD為1．84%;ICP－OES法測(cè)得微波消解法處理后的樣品鋁含量均值為239．686μg•mL－1，RSD為4．21%。結(jié)果表明，上述2種預(yù)處理方法處理樣品后用ICP－OES法測(cè)定鋁含量結(jié)果無顯著性差異，均適用于13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗鋁含量檢測(cè)，本研究選擇用0．1mol•L－1鹽酸稀釋法進(jìn)行樣品的預(yù)處理。

2．2方法學(xué)驗(yàn)證

2．2．1線性關(guān)系考察取制備好的1、5、10、15、20μg•mL－1鋁元素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照“2．1．1”項(xiàng)條件進(jìn)行測(cè)定。以鋁元素質(zhì)量濃度(μg•mL－1)為X軸，分析線的響應(yīng)值為Y軸進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果表明鋁元素質(zhì)量濃度在1～20μg•mL－1范圍內(nèi)，與響應(yīng)值具有良好的線性關(guān)系。

2．2．2重復(fù)性試驗(yàn)取樣品(批號(hào)CN0002)9份，按照“2．1．3”項(xiàng)下用0．1mol•L－1鹽酸稀釋處理制備供試品溶液，應(yīng)用ICP－OES法檢測(cè)，結(jié)果鋁含量的均值為216．761μg•mL－1，RSD為0．76%，表明此方法精密度良好。

2．2．3回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品(批號(hào)CN0002)9份，用0．1mol•L－1鹽酸稀釋25倍，各取15mL，平均分為3組，分別加入用0．1mol•L－1鹽酸稀釋至9．511μg•mL－1鋁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液5、15和45mL，加入的鋁終質(zhì)量濃度分別為2．3778、4．7555和7．1332μg•mL－1。室溫放置24h后，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，回收率均在90%～110%之間。鋁含量平均回收率及RSD結(jié)果見表1。

2．2．4檢出限和定量限將空白對(duì)照溶液(去離子水)連續(xù)進(jìn)樣11次，按照“2．1．1”項(xiàng)條件測(cè)得溶液中鋁含量，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)值。結(jié)果顯示，空白溶液連續(xù)進(jìn)樣11次，測(cè)定結(jié)果的均值為0．0055μg•mL－1，SD為0．0050μg•mL－1，檢出限為0．015μg•mL－1(3SD)，當(dāng)供試品溶液濃度低于檢出限時(shí)為未檢出;定量限為0．050μg•mL－1(10SD)，當(dāng)測(cè)定結(jié)果低于定量限時(shí)，樣品的測(cè)定結(jié)果被認(rèn)為不可靠。

2．2．5專屬性考察0．04%氯化鈉0．1mol•L－1鹽酸、0．1mol•L－1氯化鋰0．1mol•L－1鹽酸和1．3%硝酸溶液分別作為陰性對(duì)照1、陰性對(duì)照2和陰性對(duì)照3。陰性對(duì)照1、2和3放置24h后進(jìn)行鋁含量檢測(cè)。從結(jié)果中可以看出，陰性對(duì)照1、陰性對(duì)照2和陰性對(duì)照3的測(cè)定值均低于檢出限，說明0．04%氯化鈉、0．1mol•L－1鹽酸、0．1mol•L－1氯化鋰0．1mol•L－1鹽酸和1．3%硝酸不影響鋁含量的檢測(cè)。結(jié)果見表2。

2．2．6溶液中鋁含量穩(wěn)定性研究取樣品10份混合均勻，2～8℃放置，在測(cè)定前5d、4d、2d、24h和2h分別按“2．1．3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各3份，室溫下放置，用ICP－OES法進(jìn)行鋁含量測(cè)定，結(jié)果顯示5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果的RSD＜6%，表明0．1mol•L－1鹽酸稀釋處理的供試品溶液在室溫放置5d內(nèi)鋁含量穩(wěn)定性良好，鹽酸處理2h與處理24h無顯著性差異。

2．3樣品檢測(cè)取13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗樣品3批，按“2．1．3”項(xiàng)下方法以0．1mol•L－1鹽酸制備供試品溶液，按照“2．1．1”項(xiàng)條件測(cè)得溶液中鋁含量，與化學(xué)滴定法相比較，結(jié)果均在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。見表3。

3討論

肺炎球菌結(jié)合疫苗中添加了鋁離子作為佐劑提高免疫效果。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，分別考察了0．1mol•L－1鹽酸稀釋處理和微波消解法處理結(jié)合疫苗，結(jié)果表明此2種方法處理方法均適用于13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗鋁含量檢測(cè)，本文根據(jù)操作簡(jiǎn)便原則選擇0．1mol•L－1鹽酸處理樣品。本文對(duì)ICP－OES法檢測(cè)鋁含量的方法學(xué)線性、重復(fù)性、回收率(準(zhǔn)確度)、專屬性和溶液穩(wěn)定性多方面進(jìn)行了考察，并且確定了此方法的檢出限和定量限。結(jié)果顯示:線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線r值大于0．9999;重復(fù)性RSD低于1%;回收率均在90%～110%之間;專屬性研究發(fā)現(xiàn)，溶液中存在鈉離子和鋰離子均不會(huì)影響13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗中鋁含量的檢測(cè);溶液穩(wěn)定性結(jié)果顯示，0．1mol•L－1鹽酸稀釋的樣品溶液鋁含量在室溫放置5d內(nèi)穩(wěn)定性良好。應(yīng)用ICP－OES法檢測(cè)樣品鋁含量，結(jié)果顯示測(cè)定值均在理論值的85%～115%。13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗中磷酸鋁作為佐劑，確定鋁含量是控制肺炎球菌結(jié)合疫苗質(zhì)量的一項(xiàng)重要質(zhì)控指標(biāo)。本試驗(yàn)建立了ICP－OES法檢測(cè)13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗鋁含量的測(cè)定方法，該方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能夠取代中國藥典中規(guī)定的滴定法測(cè)定鋁含量，可為13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗的質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)和參考。

作者：陳瓊 王瑾 石繼春 王春娥 陳翠萍 葉強(qiáng) 單位：中國食品藥品檢定研究院