藥用輔料橄欖油中甾醇譜的研究范文

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《藥物分析雜志》2015年第十一期

油脂類輔料作為一類源于食品工業(yè)(通常被認(rèn)為是安全的:美國(guó)FDA列入GRAS)應(yīng)用于制藥中已經(jīng)有相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，大多應(yīng)用于生產(chǎn)注射劑、乳劑、潤(rùn)滑劑、營(yíng)養(yǎng)劑等的藥用輔料。常用的油脂類輔料植物油有橄欖油、大豆油、杏仁油、花生油、玉米油、椰子油等。植物油中含有比較豐富的植物甾醇，不同的植物油中甾醇組成差異較大，故甾醇組成及含量在植物油的評(píng)價(jià)中發(fā)揮著重要作用。目前藥用輔料植物油的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，并不包括甾醇組成的檢查。測(cè)定植物甾醇的方法有很多。早期的方法［1］有毛地黃皂甙沉淀法、Liebermann－Burhcard可見(jiàn)光比色法、酶法等，但是這些方法干擾因素較多，且只能測(cè)定甾醇總含量，不能對(duì)各甾醇組成進(jìn)行分離鑒別。后有文獻(xiàn)報(bào)道利用薄層色譜法(TLC)［2］分離和分析植物甾醇和植物甾醇酯，根據(jù)斑點(diǎn)的大小和顏色的深淺雖然可判斷各甾醇組分的大致比例，但該方法靈敏度和定量準(zhǔn)確度較低。目前研究最多的方法是高效液相色譜(HPLC)［3］、衍生化處理－氣相色譜(GC)［4］和氣相色譜法－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)等現(xiàn)代色譜分析方法，這些方法不僅能測(cè)定植物甾醇的總量，還能夠分別定量檢測(cè)出各甾醇組分的含量。本研究選用橄欖油作為研究對(duì)象，將高效液相色譜法和衍生化處理－氣相色譜法聯(lián)合運(yùn)用，分析橄欖油中的甾醇組成及百分含量。

1儀器與試藥

1.1儀器美國(guó)Agilent公司1200/1260型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司7890型氣相色譜儀;CARBOLITE電熱恒溫干燥箱，上海一恒科技有限公司DZF－6030A型真空干燥箱。

1.2試藥乙醇、石油醚(40～50℃)、丙酮、吡啶等試劑為分析純，異丙醇、正己烷為色譜純，水為超純水。橄欖油(共3批，1個(gè)企業(yè))，葵花籽油對(duì)照(批號(hào)MKBK1503V，Sigma)，膽甾醇對(duì)照品(批號(hào)111618－200301，中國(guó)食品藥品檢定研究院)、β－谷甾醇對(duì)照品(批號(hào)110851－201407，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1樣品處理精密稱定橄欖油、葵花籽油各5.0g，置250mL錐形瓶中，加氫氧化鉀乙醇溶液50mL，加熱回流1h進(jìn)行皂化。冷卻后移至分液漏斗中，用石油醚(40～50℃)萃取3次，每次50mL，合并石油醚提取液，置另一個(gè)分液漏斗中，用50%乙醇溶液洗滌3次，每次50mL，棄去水層，水浴去石油醚，所得殘?jiān)?05℃干燥至恒重，計(jì)算不皂化物的含量，不皂化物結(jié)果見(jiàn)表1。取所得樣品的全部不皂化物，用石油醚(40～50℃)溶解3次至試管中，每次4mL，氮?dú)獯蹈桑恿鲃?dòng)相適量(約1mL)溶解殘?jiān)?jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液，用于色譜分離分析。

2.2液相色譜分析采用Kromasil60－5SIL硅膠柱(250mm×4.6mm，5μm)，以異丙醇－正己烷(1∶99，v/v)為流動(dòng)相等度洗脫，流速1.0mL•min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量20μL。對(duì)照品及樣品的典型色譜圖見(jiàn)圖1。以膽甾醇的出峰時(shí)間為參考，收集從20min至32min的洗脫液，為提高濃度，以2次或3次液相色譜進(jìn)樣所得的洗脫液吹干后為1個(gè)供氣相分析樣品。提取的不皂化物組成比較復(fù)雜，液相色譜分離有很多雜質(zhì)，不采用同填料預(yù)柱(即硅膠)時(shí)，色譜柱進(jìn)樣多次后有很多雜質(zhì)強(qiáng)保留在柱子中，繼續(xù)進(jìn)樣供試品溶液的保留時(shí)間不斷前移使甾醇不能與其他物質(zhì)分離，因此最好使用相同填料預(yù)柱對(duì)供試品溶液在進(jìn)入色譜柱前進(jìn)行過(guò)濾。

2.3氣相色譜分析衍生化溶液的制備:取“液相色譜分析”項(xiàng)下供試品溶液洗脫收集后的殘?jiān)訜o(wú)水吡啶0.2mL，加N，O－雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)－三甲基氯硅烷(TMCS)(99∶1，v/v)0.2mL，密封，混勻，80℃加熱20min，取出，放冷，取液體層，即得供試品衍生化溶液。分別取對(duì)照品溶液、膽甾醇液相色譜洗脫收集后的殘?jiān)浴凹訜o(wú)水吡啶0.2mL”起同法操作，取液體層作為對(duì)照品衍生化溶液、膽甾醇衍生化溶液。色譜柱:DB－5毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm);進(jìn)樣口溫度:290℃;進(jìn)樣量:2～3μL;分流比為25∶1;載氣:氦氣;流速1.8mL•min－1;程序升溫:起始柱溫260℃，保持50min，再以5℃•min－1的速率升溫至290℃，保持5min。取對(duì)照品衍生化溶液、膽甾醇衍生化溶液與衍生化供試品溶液2～3μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，葵花籽油作系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，葵花籽油的甾醇色譜圖中菜油甾醇峰與豆甾醇峰的分離度大于4.0。本實(shí)驗(yàn)中，葵花籽油的甾醇色譜圖中菜油甾醇峰與豆甾醇峰的分離度為4.43。按表2所附的相對(duì)β－谷甾醇峰的保留時(shí)間［7］鑒別各甾醇峰，各甾醇峰相對(duì)β－谷甾醇峰的保留時(shí)間見(jiàn)表2。空白色譜圖(A)、葵花籽油典型色譜圖(B)以及橄欖油典型色譜圖(C)見(jiàn)圖2。根據(jù)所得氣相色譜圖，計(jì)算從膽甾醇到△7－燕麥甾醇15個(gè)峰的總峰面積，按面積歸一化法計(jì)算各甾醇的相對(duì)含量，3批橄欖油的甾醇組成及含量見(jiàn)表3。測(cè)得橄欖油中含有多種甾醇，其中β－谷甾醇的含量比較高，占總甾醇量的80%以上，其次是菜油甾醇，△5，24－豆甾二烯醇，未檢測(cè)出24－亞甲基膽甾醇、菜油甾烷醇、△7－燕麥甾醇、樺木醇。

3討論

本研究所采用的實(shí)驗(yàn)方法，首先從橄欖油中提取不皂化物，運(yùn)用高效液相色譜法從不皂化物中分離并收集甾醇的餾分，進(jìn)一步提純，使得純度和分離度更高，然后加入硅烷化試劑對(duì)餾分進(jìn)行衍生化，并采用氣相色譜法檢測(cè)各甾醇的組成及百分含量，是一種測(cè)定植物油中甾醇組成及百分含量的較好的方法。目前，像橄欖油這類具有極佳的營(yíng)養(yǎng)保健功效、且價(jià)格昂貴的植物油，摻假現(xiàn)象屢屢發(fā)生，所以對(duì)植物油特別是昂貴的油類如橄欖油的摻假鑒別是非常重要的。在以往的研究中，植物油中脂肪酸的組成可作為摻假鑒別項(xiàng)，但是，隨著現(xiàn)代技術(shù)的不斷提高，使得摻假油中脂肪酸組成和真油中的達(dá)到一致已經(jīng)成為可能，所以只通過(guò)分析油脂類樣品中的脂肪酸組成以判定是否摻假是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。而不同植物油中甾醇組成差異較大，而且相同品種中的甾醇組成受環(huán)境條件、果實(shí)成熟度以及加工工藝的影響比較小，故甾醇組成可以作為多種植物油的指紋圖譜［8］。Dulf等［9］采用GC/FID技術(shù)分析了菜籽油和橄欖油樣品中的甾醇組成，結(jié)果顯示菜籽油中含有菜子甾醇，而在橄欖油中未檢出;β－谷甾醇與菜油甾醇比值在初榨橄欖油中較高，在菜籽油或摻假的橄欖油中比值較低;菜油甾醇與菜子甾醇在菜籽油中比值低而在特級(jí)初榨橄欖油中比值高，結(jié)合以上3個(gè)結(jié)果能很好地鑒別特級(jí)初榨橄欖油是否添加菜籽油。Grob等、Al－Dabbas等［11］通過(guò)在線耦合LC/GC/FID檢測(cè)分析植物甾醇以鑒定菜籽油、大豆油、葵花籽油對(duì)橄欖油的摻假。有文獻(xiàn)報(bào)道菜籽油含有100～1100mg•kg－1的菜籽甾醇，橄欖油含有683～2610mg•kg－1的β－谷甾醇和34～266mg•kg－1的Δ5－燕麥甾醇，這些明顯的差別對(duì)品種和摻假的檢測(cè)提供了有用的信息，因此通過(guò)測(cè)定甾醇組成及總量，可對(duì)橄欖油進(jìn)行摻假鑒別。本論文的研究也為植物油特別是昂貴的油類如橄欖油的摻假鑒別提供參考，但由于植物油脂的多樣性，組成的相似性和復(fù)雜性，還需要增加植物油脂品種和批次以及探索更好的數(shù)據(jù)處理方法，以便進(jìn)一步深入地研究。

作者：方欣欣 徐明明 鄭璐俠 陳妙芬 陳鋼 單位：上海市食品藥品檢驗(yàn)所 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院