海洋生物源肝素的研究進程范文

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《生物醫(yī)學(xué)工程研究》2018年第2期

摘要：【目的】為海洋生物源肝素的研究提供參考依據(jù)，促進海洋生物資源的綜合利用。【方法】對海洋生物源肝素的提取技術(shù)、分離純化技術(shù)、結(jié)構(gòu)鑒定、生物活性進行了歸納總結(jié)。【結(jié)果】海洋生物源肝素作為傳統(tǒng)肝素的替代原料，具有副作用小、與人體細(xì)胞兼容性好的特點，但其提取率不如陸地生物源肝素高，且對其活性機制的研究還不夠透徹，未能掌握肝素特異結(jié)構(gòu)與活性間的關(guān)系。【結(jié)論】為充分開發(fā)海洋生物源肝素，未來的研究重點應(yīng)該包括改進海洋生物源肝素的制備和合成、開發(fā)改進性能的肝素抗凝劑、開發(fā)新的生物活性以及相應(yīng)的藥物或保健品、更新肝素原料庫。

關(guān)鍵詞：肝素；海洋生物；分離純化；結(jié)構(gòu)分析；生物活性

肝素因在肝臟中發(fā)現(xiàn)而得名，是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸IdoA和D-葡萄糖醛酸GlcA)和氨基己糖(ɑ-D-葡糖胺，GlcN)及其衍生物（乙酰化、硫酸化）所組成的一種糖胺聚糖，其中硫酸基和羧基含量很高，是已知負(fù)電荷密度最高的生物大分子[1]。此外，研究表明，肝素是一種廣泛用于臨床的天然多糖類抗凝血活性物質(zhì)，具有抗凝血、抗炎、抗血管生成、抗病毒等生物活性[2]，臨床上常用于防治血栓栓塞性疾病、彌散性血管內(nèi)凝血和心肌梗塞的治療。一般而言，肝素來源于豬、牛、羊的小腸黏膜提取物，也存在于動物的血管壁和肺之中，但由于受到肝素污染事件、瘋牛病和宗教信仰的影響，陸地哺乳動物源肝素的開發(fā)受到限制，有學(xué)者提出從相對潔凈的海洋生物中尋找肝素新資源以替代陸地動物原料。海洋占地球表面積70%以上，龐大的生物庫及其獨特的環(huán)境，造就了豐富的生物資源。近年來，從海洋生物中尋找肝素來源的替代原料的研究日益增多，已有報道從海灣扇貝、多種海藻和海洋細(xì)菌、蝦、紅樹林蟹、金槍魚、青口、和文蛤等多種海洋生物中提取出來肝素[3-8]。因此，本文綜述海洋生物中肝素的提取純化技術(shù)及生物活性等方面的研究進展，旨在為海洋生物源肝素的進一步開發(fā)與利用提供參考。

1海洋生物源肝素的提取

肝素的提取過程中，主要解決的技術(shù)難題是如何在不破壞肝素理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和生物活性的情況下，斷開肝素與蛋白質(zhì)共價結(jié)合形成的糖肽鍵，從而有效去除蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)。目前對海洋生物肝素的提取主要有堿性鹽水提取法、超聲波提取法和酶解提取法。

1.1堿性鹽水提取法

堿溶液能使肝素與蛋白質(zhì)之間的糖肽鍵斷裂，從而將肝素從肝素-蛋白質(zhì)復(fù)合物中提取出來，然后利用蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中溶解度降低而沉淀，以達到去除蛋白質(zhì)的目的。該方法操作簡單，成本低廉，但并不能完全去除蛋白質(zhì)。Seedevi等[9]以硫酸鈉為鹽析劑，在pH為11.5，溫度為55℃條件下進行熱水浸提，以硫酸鋁為凝結(jié)劑除去蛋白質(zhì)，并通過十六烷基氯化吡啶（CPC)絡(luò)合沉淀，從烏賊中提取出具有抗凝活性的硫酸粘多糖。Arumugam等[7]同樣用該方法從青口和長硨磲中提取出肝素粗品，含量分別為2.2g/kg和2.72g/kg。

1.2超聲波提取法

超聲波提取法是一種物理破碎的過程，利用機械振動、熱效應(yīng)和空化作用對細(xì)胞組織進行破碎，以提高肝素在提取液中的溶解度和浸出率。作為海洋生物中肝素的新型提取方法，與傳統(tǒng)提取方法相比，具有不需加熱、提取率高、提取時間短、對生物活性的影響小和溶劑用量少等特點[10]。但是由于具有較強機械剪切作用，對目標(biāo)物的物理結(jié)構(gòu)易造成破壞作用，所以超聲處理時間不宜太長。Fidelis等[11]采用了5種方法提取紅藻中的硫酸多糖，結(jié)果表明，在堿性條件下，超聲波結(jié)合酶水解法提取的硫酸多糖的抗凝血活性和抗氧化活性最佳。

1.3酶解提取法

酶解法是提取肝素常用的方法之一，蛋白酶能夠破壞肝素與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的糖肽鍵，從而將肝素從肝素-蛋白復(fù)合物中分離出來，也可將雜蛋白分解為小分子肽。最后通過調(diào)節(jié)pH，熱變性和鹽析除去酶蛋白和被降解的蛋白質(zhì)制得肝素[12]。為了蛋白質(zhì)更好的水解，常選用廣譜型蛋白酶，例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草中性蛋白酶等。酶解法操作簡單，對目標(biāo)物影響小，同時簡化了后續(xù)脫蛋白的工藝，但對實驗穩(wěn)定性要求較高。劉斌等[13]采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶雙酶法對原料進行水解,在強肋錐螺和海灣扇貝中發(fā)現(xiàn)少量肝素。Ticar等[14]在不同酶解條件下從方斑獅子魚卵中提取出肝素類抗凝多糖，最佳條件下肝素提取率達到2.1％。Luppi等[15]采用木瓜蛋白酶對一種海洋雙殼類軟體動物CallistaChione進行酶解，制備得到一種高抗凝活性的肝素。

2海洋生物源肝素的分離、純化

經(jīng)提取后的粗品肝素除含有肝素外，還有其他種類的糖胺聚糖以及未除凈的蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)。純化目的就是要將這些雜質(zhì)除去以得到高品質(zhì)的肝素。目前海洋生物中肝素的純化主要有有機溶劑沉淀法、季銨鹽沉淀法、柱層析等方法。2.1有機溶劑沉淀法糖胺聚糖是一類水溶性物質(zhì)，不溶于乙醇、丙酮等有機溶液，且不同糖胺聚糖在同一有機溶液中的溶解度是不同的，海洋生物肝素的純化常利用這一特性將肝素與其他糖胺聚糖分離開來。有機溶液沉淀法是純化生物大分子物質(zhì)較為常用的方法，該方法不僅成本低，且操作簡便有效，但往往會造成交叉沉淀，常用分步沉淀來提高產(chǎn)品質(zhì)量。Andrade等[5]采用LEWATIT離子交換樹脂層析和60％的丙酮沉淀的方法，從紅樹林蟹中提取出肝素。Dietrich等[15]以0.5、0.6、0.7和1倍體積的丙酮對巴西對蝦提取物進行分級沉淀，在0.5和0.6倍丙酮沉淀的組分中提取出了650mg肝素。

2.2季銨鹽沉淀法

季銨鹽是一類陽離子表面活化劑，肝素是聚陰離子糖胺聚糖，能與各種陽離子反應(yīng)生成鹽。十六烷基三甲基化銨（CTAB）和十六烷基氯化吡啶（CPC）與肝素反應(yīng)生成絡(luò)合物，當(dāng)溶液鹽濃度低于臨界鹽濃度時，絡(luò)合物沉淀不溶解，當(dāng)溶液鹽濃度高于臨界鹽濃度，絡(luò)合物將解離并溶解，而臨界鹽濃度則取決于聚陰離子的電荷密度和酸根（硫酸基和羧基）解離度[16]。孫曉明[17]用CTAB沉淀法進行二次沉淀，得到抗凝活性較低的粘多糖。Saravanan[18]用CPC沉淀法對海洋軟體動物Amussiumpleuronectus提取物進行純化，得到一種低分子肝素(LMWH)。

2.3柱層析法

柱層析法是肝素提純中最為常用且有效的方法之一，主要有離子交換層析法和凝膠層析法。離子交換層析的原理是用離子交換劑作固定相，利用它與流動相中的某種離子發(fā)生相互交換和競爭結(jié)合的反應(yīng)來分離混合物。用于純化肝素的離子交換劑有AmberliteIRA120/900、DEAE-Cellulose、SephadexA-25和D254樹脂等陰離子交換樹脂，目前國內(nèi)常用D254樹脂，該樹脂對肝素鈉的選擇性較好，且成本低[1]。凝膠柱層析中的固定相是具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔性凝膠，混合溶液流經(jīng)凝膠時，小分子物質(zhì)易流進凝膠，大分子物質(zhì)不進入凝膠，洗脫時相對分子量大的物質(zhì)先流出，分子量小的物質(zhì)后流出，以此來分離不同相對分子量的物質(zhì)。目前的凝膠主要有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖-瓊脂糖混合凝膠和瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠等[19]。凝膠柱層析法不僅分辨率高，能將性質(zhì)相近的組分分離，而且回收率高，分離條件緩和。不過分離操作一般較慢[20]。Chavavte等[21]從凡納濱對蝦蝦頭中提取出具有抗炎活性的肝素，并用DEAE-Sephacel離子交換層析法和SephadexG-25凝膠層析法進行純化，純化后的蝦頭肝素效價為51U/mg。Cesaretti等[22]用SephadexA-25離子交換層析對海蛤肝素粗品進行純化，通過梯度洗脫得到單一組分，經(jīng)瓊脂凝膠電泳分析顯示除肝素外僅有少量硫酸軟骨素存在，說明純化效果好。Flengsrud等[23]以抗凝血酶偶聯(lián)瓊脂糖為固相吸附劑進行親和層析，從蛙魚中分離出了高親和力肝素。

3海洋生物源肝素分析測定方法

3.1肝素效價的測定

肝素效價的測定主要有天青A比色法，生色底物法和生物檢定法。天青A為陽離子物質(zhì)，能與肝素形成肝素-天青A復(fù)合物，該復(fù)合物在紫外光505nm處有吸收，根據(jù)吸光度來判斷肝素效價。天青A比色法具有操作簡單，耗時短特點。發(fā)色底物法操作較為復(fù)雜，所用試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用，目前已開發(fā)出抗FXα因子試劑盒，抗Ⅱα因子效價試劑盒和抗Xα因子效價試劑盒，使操作簡單化和程序化，該方法是目前測定肝素效價最為常用的方法。生物檢定法包括羊血漿法和兔全血法，該方法操作簡單，但耗時長，且主觀誤差較大。Andrade等[5]采用發(fā)色底物法測得蟹肝素效價為33U/mg，低于普通肝素，并表明其低抗凝活性與其較低硫酸化程度有關(guān)。Jeske等[6]采用同樣方法測得金槍魚肝素抗Xa因子最高效價為72U/mg，抗凝血酶最高活性為111U/mg。

3.2肝素結(jié)構(gòu)的分析

肝素的結(jié)構(gòu)與其生物活性密切相關(guān)，因此需要對其結(jié)構(gòu)進行分析。肝素結(jié)構(gòu)的測定一般包括分子量的測定、單糖組成分析、紅外光譜分析和核磁共振分析等。肝素主要是由兩種二糖單位（氨基糖和糖醛酸）重復(fù)聚合構(gòu)成,分離得到的二糖單位重復(fù)數(shù)不同,所測的分子量會有所差異，常用方法有高效液相色譜法、凝膠排阻色譜法和滲透壓法。單糖組成的分析需要將肝素降解為單糖，再通過色譜法和電泳法進行鑒定分析[24]，傳統(tǒng)的降解方式是鹽酸水解，近年來多用三氟乙酸(TFA)進行水解[25]。基團的連接方式、內(nèi)部排列順序和異頭碳的結(jié)構(gòu)等都不能依靠一種分析技術(shù)分析出來，需要結(jié)合多種分析方法才能完成。LI等[26]用熱水浸提法從海藻中提取出一種具有抗凝活性的硫酸化多糖，經(jīng)高效液相凝膠色譜(HPGPC)分析，該糖平均分子質(zhì)量為513ku，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）分析其單糖組成，結(jié)果表明該糖由鼠李糖(84.0%)，木糖(4.8%)，葡萄糖(4.6%)，半乳糖(2.3%)，甘露糖(1.9%)和葡萄糖醛酸(2.4%)組成。Saravanan等[18]對海洋扇貝硫酸乙酰肝素（HS）進行提取，經(jīng)核磁共振法（HNMR）分析顯示，海洋扇貝HS富含葡萄糖醛酸和硫酸化的艾杜糖醛酸殘基，且硫酸化程度高，其抗凝血活性與肝素相當(dāng)。曹九零等[27]建立了一種新型分析方法，多糖經(jīng)TFA水解和PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生化后采用HPLC-MSn（高效液相色譜-多級質(zhì)譜聯(lián)用）分析水解產(chǎn)物中的二糖片段，從而鑒定出含糖醛酸的多糖種類，并通過此方法在菲律賓蛤仔、紫石房蛤、文蛤和四角蛤蜊中發(fā)現(xiàn)了肝素的存在。Jeske等[6]用凝膠滲透色譜-高效液相色譜聯(lián)用法（GPC-HPLC）對純化后的金槍魚魚皮肝素進行分析，其平均分子質(zhì)量為12ku，與臨床級的豬肝素分子質(zhì)量相當(dāng)。

4海洋生物源肝素的生物活性

肝素具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，同時還具有多樣的生物活性。除常見的抗凝血作用之外，還有抗腫瘤、抗平滑肌細(xì)胞增殖和抗炎癥等作用，肝素的這些生物活性與其特異的結(jié)構(gòu)有關(guān)，與抗凝血作用無關(guān)[1]。由于海洋環(huán)境的獨特性，海洋源肝素與陸地生物肝素在組成與結(jié)構(gòu)上存在明顯差異，因此具有一些獨特的生物活性。近年來，海洋生物源肝素的藥用潛力逐漸被發(fā)掘出來，比陸地生物源肝素的更多活性功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)。

4.1抗凝血作用

人體中的血液之所以能維持順暢的流動，是因為促凝系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)處于一個平衡的狀態(tài)，前者可形成血塊，達到止血的目的，后者阻止血塊形成，以保持血管通暢。肝素的主要抗凝機制在于肝素分子鏈上含有與抗凝血酶（AT）高親和力的五糖，當(dāng)肝素與AT接觸后，發(fā)生構(gòu)象改變，暴露出反應(yīng)中心環(huán)（RCL），RCL含有重要的蛋白酶底物序列，作用于凝血酶等絲氨酸蛋白酶活性部位，催化其滅活。滅活后若還存在游離AT，肝素可解脫下來催化下一個AT。因此肝素-AT復(fù)合物能滅活凝血系統(tǒng)中多數(shù)活化的酶，起到抗凝血的作用[1]。肝素的另一個作用機制是激活肝素輔因子Ⅱ而直接滅活凝血因子Ⅱa，該作用是電荷依賴性，不需要依賴五糖結(jié)構(gòu)，但需要較高的肝素濃度，當(dāng)AT嚴(yán)重缺乏時，該機制可發(fā)揮作用[28]。Cesaretti等[22]從一種雙殼軟體動物Tapesphylippinarum中提取出具有高抗凝血活性的肝素，其APTT值為347±56.6，抗Xa因子活性為317±48.3，高于牛肝素抗凝活性（APPT：145±24.6；抗Xa因子：125±18.7）。Flengsrud等[23]以家兔為實驗對象進行了動物實驗，發(fā)現(xiàn)蛙魚肝素能夠激活抗凝血酶抑制凝血因子IIa和Xa活性的能力。Volpi[29]報道軟體動物沒有類似哺乳動物的凝血系統(tǒng)，但它們的肝素能夠顯著促進哺乳動物凝血酶的失活，從而起到抗凝血作用。

4.2抗血栓作用

抗血栓的概念是指機體內(nèi)預(yù)防血栓的形成和溶解已形成的血栓。能抗凝血的藥物必定有抗血栓的作用，但有抗血栓作用的物質(zhì)不一定有或只有微弱的抗凝血活性[1]。血栓形成后，為保持血液順暢，機體會立即啟動纖溶系統(tǒng)以溶解纖維蛋白和血栓。纖溶是由纖溶酶原活化素（PA）激活纖溶酶原引發(fā)的。可由組織型PA啟動，也可由FⅫa活化激肽釋放酶原，激肽釋放酶再激活未經(jīng)活化的尿激酶型PA（u-PA）。肝素可提高血漿PA濃度，抑制PA抑制劑，并增強t-PA和u-PA的作用，而促進血栓溶解。另一方面，血液凝固過程中會產(chǎn)生FⅡa和凝血酶，后者會活化纖溶抑制物（TAFI），導(dǎo)致纖溶酶原活化受阻，纖溶酶不能形成，而不能發(fā)揮溶解血塊的纖溶作用。FⅡa與內(nèi)皮細(xì)胞表面血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）結(jié)合可使TAFI活化增大1250倍，抗纖溶作用顯著提高。研究表明，治療性濃度的高分子肝素與LMWH均可顯著降低FⅡa與TM的親和力，減少TAFI活化以增強纖溶作用[30]。Dietrich[15]等建立激光誘導(dǎo)大鼠血栓形成模型來測定蝦肝素的抗血栓活性，實驗結(jié)果表明，巴西對蝦肝素具有與低分子量肝素相當(dāng)?shù)目寡ㄐ纬苫钚浴omes等[31]從一種軟體動物中提取出類肝素化合物，通過體內(nèi)實驗證明，當(dāng)劑量為1mg/kg時，該化合物能夠有效抑制光損傷動脈血栓的形成。

4.3抗炎作用

炎癥是由T淋巴細(xì)胞,抗體或非免疫組織的損傷引起的免疫識別開始的,免疫識別觸發(fā)了白細(xì)胞的激活、穿透和激素級聯(lián)放大系統(tǒng)從而引起的一系列反應(yīng)統(tǒng)稱為炎癥。在炎癥反應(yīng)過程中，選擇素通過與相應(yīng)的配體結(jié)合介導(dǎo)白細(xì)胞與血管壁接觸，并使其在血管壁上滾動，最終導(dǎo)致白細(xì)胞在炎癥反應(yīng)區(qū)域聚集，而肝素與相應(yīng)的葡萄糖胺多糖能與選擇素分組結(jié)合，干擾自然配體的作用，從而抑制嗜中性粒細(xì)胞與活化的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合[32]。Gomes等[33]從一種軟體動物Nodipectennodosus中得到了一種肝素類似物，能抑制小鼠脂肪性腹腔炎所致的內(nèi)皮細(xì)胞活化和炎癥細(xì)胞的聚集。Brito等[34]從凡納濱對蝦蝦頭中提取出了肝素，在急性炎癥模型中，除了能顯著減少炎癥細(xì)胞流入損傷部位外，還能降低炎癥動物腹腔灌洗液中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）的活性。此外，該化合物具有較低的出血效應(yīng)，可作為潛在的抗炎藥物。

4.4其他活性

肝素的結(jié)構(gòu)是糖胺聚糖中最復(fù)雜的，與此相對應(yīng)的是多樣的生物活性。除了上述提到的生物學(xué)功能，肝素還具有抗血管生成、抗腫瘤和抗平滑肌增殖等生物活性。Gomes等[33]從軟體動物Nodipectennodosus提取的肝素除了具有抗炎活性外，還具有抗腫瘤的作用，該物質(zhì)通過抑制血管中血小板-腫瘤細(xì)胞復(fù)合體的形成，顯著地抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Arumugam等[7]從青口和長硨磲中分離出具有抗增殖活性的肝素，通過肺動脈平滑肌細(xì)胞進行抗增殖試驗，結(jié)果表明青口肝素比長硨磲肝素的抗增殖活性更好。Dreyfuss[35]等報道從蝦頭中提取的肝素在激光誘導(dǎo)的CNV及體外模型中的抗血管生成作用，該化合物與生長因子（FGF-2、EGF和VEGF）結(jié)合，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，可作為治療老年性黃斑病變的潛在藥物。

5展望

肝素具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及多樣的生物活性，在臨床上發(fā)揮了巨大作用，對肝素的研究必將會延續(xù)到新世紀(jì)。海洋生物源肝素作為傳統(tǒng)肝素的替代原料，具有副作用小，與人體細(xì)胞兼容性好的特點，但研究上仍有許多問題有待解決，如提取率不如陸地生物源肝素高，無法產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；對其活性機制的研究還不夠透徹；未能掌握肝素特異結(jié)構(gòu)與活性間的關(guān)系等。所以未來的研究重點應(yīng)該包括（1）改進海洋生物源肝素的制備和合成，開發(fā)出更成熟的提取方法并最終實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；（2）開發(fā)改進性能的肝素抗凝劑，可研究肝素產(chǎn)生某一副作用的分子量范圍，在制備中剔除那一分子量范圍的肝素，做到無副作用；（3）開發(fā)新的生物活性以及相應(yīng)的藥物或保健品；（4）更新肝素原料庫，從更多的海洋生物中提取出肝素。從海洋生物中提取的肝素具有良好的組織結(jié)構(gòu)和抗凝血活性，關(guān)于抗血栓、抗炎癥、抗血管生成等生物活性已有一些研究，但還有許多活性有待開發(fā)，海洋生物源肝素在天然產(chǎn)物藥物的開發(fā)和用于治療的新的衍生產(chǎn)品方面具有很大的潛力[36]。隨著科技發(fā)展，對其結(jié)構(gòu)和活性的研究將會更深入，海洋肝素將有望實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，開發(fā)出各種海洋保健品和藥品等，實現(xiàn)海洋生物資源的深入開發(fā)與利用。

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作者：杜振興1；周斯儀1；鐘賽意1,2,3；黃鳳嬌1；陳觀蘭1；陳菁1；洪鵬志1,3；章超樺1,3 單位：1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，2.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室