海洋生物源肝素的研究進程范文
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《生物醫學工程研究》2018年第2期
摘要：【目的】為海洋生物源肝素的研究提供參考依據，促進海洋生物資源的綜合利用。【方法】對海洋生物源肝素的提取技術、分離純化技術、結構鑒定、生物活性進行了歸納總結。【結果】海洋生物源肝素作為傳統肝素的替代原料，具有副作用小、與人體細胞兼容性好的特點，但其提取率不如陸地生物源肝素高，且對其活性機制的研究還不夠透徹，未能掌握肝素特異結構與活性間的關系。【結論】為充分開發海洋生物源肝素，未來的研究重點應該包括改進海洋生物源肝素的制備和合成、開發改進性能的肝素抗凝劑、開發新的生物活性以及相應的藥物或保健品、更新肝素原料庫。
關鍵詞：肝素；海洋生物；分離純化；結構分析；生物活性
肝素因在肝臟中發現而得名，是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸IdoA和D-葡萄糖醛酸GlcA)和氨基己糖(ɑ-D-葡糖胺，GlcN)及其衍生物（乙酰化、硫酸化）所組成的一種糖胺聚糖，其中硫酸基和羧基含量很高，是已知負電荷密度最高的生物大分子[1]。此外，研究表明，肝素是一種廣泛用于臨床的天然多糖類抗凝血活性物質，具有抗凝血、抗炎、抗血管生成、抗病毒等生物活性[2]，臨床上常用于防治血栓栓塞性疾病、彌散性血管內凝血和心肌梗塞的治療。一般而言，肝素來源于豬、牛、羊的小腸黏膜提取物，也存在于動物的血管壁和肺之中，但由于受到肝素污染事件、瘋牛病和宗教信仰的影響，陸地哺乳動物源肝素的開發受到限制，有學者提出從相對潔凈的海洋生物中尋找肝素新資源以替代陸地動物原料。海洋占地球表面積70%以上，龐大的生物庫及其獨特的環境，造就了豐富的生物資源。近年來，從海洋生物中尋找肝素來源的替代原料的研究日益增多，已有報道從海灣扇貝、多種海藻和海洋細菌、蝦、紅樹林蟹、金槍魚、青口、和文蛤等多種海洋生物中提取出來肝素[3-8]。因此，本文綜述海洋生物中肝素的提取純化技術及生物活性等方面的研究進展，旨在為海洋生物源肝素的進一步開發與利用提供參考。
1海洋生物源肝素的提取
肝素的提取過程中，主要解決的技術難題是如何在不破壞肝素理化性質、結構特征和生物活性的情況下，斷開肝素與蛋白質共價結合形成的糖肽鍵，從而有效去除蛋白質以及其他雜質。目前對海洋生物肝素的提取主要有堿性鹽水提取法、超聲波提取法和酶解提取法。
1.1堿性鹽水提取法
堿溶液能使肝素與蛋白質之間的糖肽鍵斷裂，從而將肝素從肝素-蛋白質復合物中提取出來，然后利用蛋白質在高濃度鹽溶液中溶解度降低而沉淀，以達到去除蛋白質的目的。該方法操作簡單，成本低廉，但并不能完全去除蛋白質。Seedevi等[9]以硫酸鈉為鹽析劑，在pH為11.5，溫度為55℃條件下進行熱水浸提，以硫酸鋁為凝結劑除去蛋白質，并通過十六烷基氯化吡啶（CPC)絡合沉淀，從烏賊中提取出具有抗凝活性的硫酸粘多糖。Arumugam等[7]同樣用該方法從青口和長硨磲中提取出肝素粗品，含量分別為2.2g/kg和2.72g/kg。
1.2超聲波提取法
超聲波提取法是一種物理破碎的過程，利用機械振動、熱效應和空化作用對細胞組織進行破碎，以提高肝素在提取液中的溶解度和浸出率。作為海洋生物中肝素的新型提取方法，與傳統提取方法相比，具有不需加熱、提取率高、提取時間短、對生物活性的影響小和溶劑用量少等特點[10]。但是由于具有較強機械剪切作用，對目標物的物理結構易造成破壞作用，所以超聲處理時間不宜太長。Fidelis等[11]采用了5種方法提取紅藻中的硫酸多糖，結果表明，在堿性條件下，超聲波結合酶水解法提取的硫酸多糖的抗凝血活性和抗氧化活性最佳。
1.3酶解提取法
酶解法是提取肝素常用的方法之一，蛋白酶能夠破壞肝素與蛋白質共價結合的糖肽鍵，從而將肝素從肝素-蛋白復合物中分離出來，也可將雜蛋白分解為小分子肽。最后通過調節pH，熱變性和鹽析除去酶蛋白和被降解的蛋白質制得肝素[12]。為了蛋白質更好的水解，常選用廣譜型蛋白酶，例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草中性蛋白酶等。酶解法操作簡單，對目標物影響小，同時簡化了后續脫蛋白的工藝，但對實驗穩定性要求較高。劉斌等[13]采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶雙酶法對原料進行水解,在強肋錐螺和海灣扇貝中發現少量肝素。Ticar等[14]在不同酶解條件下從方斑獅子魚卵中提取出肝素類抗凝多糖，最佳條件下肝素提取率達到2.1％。Luppi等[15]采用木瓜蛋白酶對一種海洋雙殼類軟體動物CallistaChione進行酶解，制備得到一種高抗凝活性的肝素。
2海洋生物源肝素的分離、純化
經提取后的粗品肝素除含有肝素外，還有其他種類的糖胺聚糖以及未除凈的蛋白質和核酸等雜質。純化目的就是要將這些雜質除去以得到高品質的肝素。目前海洋生物中肝素的純化主要有有機溶劑沉淀法、季銨鹽沉淀法、柱層析等方法。2.1有機溶劑沉淀法糖胺聚糖是一類水溶性物質，不溶于乙醇、丙酮等有機溶液，且不同糖胺聚糖在同一有機溶液中的溶解度是不同的，海洋生物肝素的純化常利用這一特性將肝素與其他糖胺聚糖分離開來。有機溶液沉淀法是純化生物大分子物質較為常用的方法，該方法不僅成本低，且操作簡便有效，但往往會造成交叉沉淀，常用分步沉淀來提高產品質量。Andrade等[5]采用LEWATIT離子交換樹脂層析和60％的丙酮沉淀的方法，從紅樹林蟹中提取出肝素。Dietrich等[15]以0.5、0.6、0.7和1倍體積的丙酮對巴西對蝦提取物進行分級沉淀，在0.5和0.6倍丙酮沉淀的組分中提取出了650mg肝素。
2.2季銨鹽沉淀法
季銨鹽是一類陽離子表面活化劑，肝素是聚陰離子糖胺聚糖，能與各種陽離子反應生成鹽。十六烷基三甲基化銨（CTAB）和十六烷基氯化吡啶（CPC）與肝素反應生成絡合物，當溶液鹽濃度低于臨界鹽濃度時，絡合物沉淀不溶解，當溶液鹽濃度高于臨界鹽濃度，絡合物將解離并溶解，而臨界鹽濃度則取決于聚陰離子的電荷密度和酸根（硫酸基和羧基）解離度[16]。孫曉明[17]用CTAB沉淀法進行二次沉淀，得到抗凝活性較低的粘多糖。Saravanan[18]用CPC沉淀法對海洋軟體動物Amussiumpleuronectus提取物進行純化，得到一種低分子肝素(LMWH)。
2.3柱層析法
柱層析法是肝素提純中最為常用且有效的方法之一，主要有離子交換層析法和凝膠層析法。離子交換層析的原理是用離子交換劑作固定相，利用它與流動相中的某種離子發生相互交換和競爭結合的反應來分離混合物。用于純化肝素的離子交換劑有AmberliteIRA120/900、DEAE-Cellulose、SephadexA-25和D254樹脂等陰離子交換樹脂，目前國內常用D254樹脂，該樹脂對肝素鈉的選擇性較好，且成本低[1]。凝膠柱層析中的固定相是具有三維網狀結構的多孔性凝膠，混合溶液流經凝膠時，小分子物質易流進凝膠，大分子物質不進入凝膠，洗脫時相對分子量大的物質先流出，分子量小的物質后流出，以此來分離不同相對分子量的物質。目前的凝膠主要有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖-瓊脂糖混合凝膠和瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠等[19]。凝膠柱層析法不僅分辨率高，能將性質相近的組分分離，而且回收率高，分離條件緩和。不過分離操作一般較慢[20]。Chavavte等[21]從凡納濱對蝦蝦頭中提取出具有抗炎活性的肝素，并用DEAE-Sephacel離子交換層析法和SephadexG-25凝膠層析法進行純化，純化后的蝦頭肝素效價為51U/mg。Cesaretti等[22]用SephadexA-25離子交換層析對海蛤肝素粗品進行純化，通過梯度洗脫得到單一組分，經瓊脂凝膠電泳分析顯示除肝素外僅有少量硫酸軟骨素存在，說明純化效果好。Flengsrud等[23]以抗凝血酶偶聯瓊脂糖為固相吸附劑進行親和層析，從蛙魚中分離出了高親和力肝素。
3海洋生物源肝素分析測定方法
3.1肝素效價的測定
肝素效價的測定主要有天青A比色法，生色底物法和生物檢定法。天青A為陽離子物質，能與肝素形成肝素-天青A復合物，該復合物在紫外光505nm處有吸收，根據吸光度來判斷肝素效價。天青A比色法具有操作簡單，耗時短特點。發色底物法操作較為復雜，所用試劑需要現配現用，目前已開發出抗FXα因子試劑盒，抗Ⅱα因子效價試劑盒和抗Xα因子效價試劑盒，使操作簡單化和程序化，該方法是目前測定肝素效價最為常用的方法。生物檢定法包括羊血漿法和兔全血法，該方法操作簡單，但耗時長，且主觀誤差較大。Andrade等[5]采用發色底物法測得蟹肝素效價為33U/mg，低于普通肝素，并表明其低抗凝活性與其較低硫酸化程度有關。Jeske等[6]采用同樣方法測得金槍魚肝素抗Xa因子最高效價為72U/mg，抗凝血酶最高活性為111U/mg。
3.2肝素結構的分析
肝素的結構與其生物活性密切相關，因此需要對其結構進行分析。肝素結構的測定一般包括分子量的測定、單糖組成分析、紅外光譜分析和核磁共振分析等。肝素主要是由兩種二糖單位（氨基糖和糖醛酸）重復聚合構成,分離得到的二糖單位重復數不同,所測的分子量會有所差異，常用方法有高效液相色譜法、凝膠排阻色譜法和滲透壓法。單糖組成的分析需要將肝素降解為單糖，再通過色譜法和電泳法進行鑒定分析[24]，傳統的降解方式是鹽酸水解，近年來多用三氟乙酸(TFA)進行水解[25]。基團的連接方式、內部排列順序和異頭碳的結構等都不能依靠一種分析技術分析出來，需要結合多種分析方法才能完成。LI等[26]用熱水浸提法從海藻中提取出一種具有抗凝活性的硫酸化多糖，經高效液相凝膠色譜(HPGPC)分析，該糖平均分子質量為513ku，經高效液相色譜（HPLC）分析其單糖組成，結果表明該糖由鼠李糖(84.0%)，木糖(4.8%)，葡萄糖(4.6%)，半乳糖(2.3%)，甘露糖(1.9%)和葡萄糖醛酸(2.4%)組成。Saravanan等[18]對海洋扇貝硫酸乙酰肝素（HS）進行提取，經核磁共振法（HNMR）分析顯示，海洋扇貝HS富含葡萄糖醛酸和硫酸化的艾杜糖醛酸殘基，且硫酸化程度高，其抗凝血活性與肝素相當。曹九零等[27]建立了一種新型分析方法，多糖經TFA水解和PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生化后采用HPLC-MSn（高效液相色譜-多級質譜聯用）分析水解產物中的二糖片段，從而鑒定出含糖醛酸的多糖種類，并通過此方法在菲律賓蛤仔、紫石房蛤、文蛤和四角蛤蜊中發現了肝素的存在。Jeske等[6]用凝膠滲透色譜-高效液相色譜聯用法（GPC-HPLC）對純化后的金槍魚魚皮肝素進行分析，其平均分子質量為12ku，與臨床級的豬肝素分子質量相當。
4海洋生物源肝素的生物活性
肝素具有復雜的結構，同時還具有多樣的生物活性。除常見的抗凝血作用之外，還有抗腫瘤、抗平滑肌細胞增殖和抗炎癥等作用，肝素的這些生物活性與其特異的結構有關，與抗凝血作用無關[1]。由于海洋環境的獨特性，海洋源肝素與陸地生物肝素在組成與結構上存在明顯差異，因此具有一些獨特的生物活性。近年來，海洋生物源肝素的藥用潛力逐漸被發掘出來，比陸地生物源肝素的更多活性功能也逐漸被發現。
4.1抗凝血作用
人體中的血液之所以能維持順暢的流動，是因為促凝系統和抗凝系統處于一個平衡的狀態，前者可形成血塊，達到止血的目的，后者阻止血塊形成，以保持血管通暢。肝素的主要抗凝機制在于肝素分子鏈上含有與抗凝血酶（AT）高親和力的五糖，當肝素與AT接觸后，發生構象改變，暴露出反應中心環（RCL），RCL含有重要的蛋白酶底物序列，作用于凝血酶等絲氨酸蛋白酶活性部位，催化其滅活。滅活后若還存在游離AT，肝素可解脫下來催化下一個AT。因此肝素-AT復合物能滅活凝血系統中多數活化的酶，起到抗凝血的作用[1]。肝素的另一個作用機制是激活肝素輔因子Ⅱ而直接滅活凝血因子Ⅱa，該作用是電荷依賴性，不需要依賴五糖結構，但需要較高的肝素濃度，當AT嚴重缺乏時，該機制可發揮作用[28]。Cesaretti等[22]從一種雙殼軟體動物Tapesphylippinarum中提取出具有高抗凝血活性的肝素，其APTT值為347±56.6，抗Xa因子活性為317±48.3，高于牛肝素抗凝活性（APPT：145±24.6；抗Xa因子：125±18.7）。Flengsrud等[23]以家兔為實驗對象進行了動物實驗，發現蛙魚肝素能夠激活抗凝血酶抑制凝血因子IIa和Xa活性的能力。Volpi[29]報道軟體動物沒有類似哺乳動物的凝血系統，但它們的肝素能夠顯著促進哺乳動物凝血酶的失活，從而起到抗凝血作用。
4.2抗血栓作用
抗血栓的概念是指機體內預防血栓的形成和溶解已形成的血栓。能抗凝血的藥物必定有抗血栓的作用，但有抗血栓作用的物質不一定有或只有微弱的抗凝血活性[1]。血栓形成后，為保持血液順暢，機體會立即啟動纖溶系統以溶解纖維蛋白和血栓。纖溶是由纖溶酶原活化素（PA）激活纖溶酶原引發的。可由組織型PA啟動，也可由FⅫa活化激肽釋放酶原，激肽釋放酶再激活未經活化的尿激酶型PA（u-PA）。肝素可提高血漿PA濃度，抑制PA抑制劑，并增強t-PA和u-PA的作用，而促進血栓溶解。另一方面，血液凝固過程中會產生FⅡa和凝血酶，后者會活化纖溶抑制物（TAFI），導致纖溶酶原活化受阻，纖溶酶不能形成，而不能發揮溶解血塊的纖溶作用。FⅡa與內皮細胞表面血栓調節蛋白（TM）結合可使TAFI活化增大1250倍，抗纖溶作用顯著提高。研究表明，治療性濃度的高分子肝素與LMWH均可顯著降低FⅡa與TM的親和力，減少TAFI活化以增強纖溶作用[30]。Dietrich[15]等建立激光誘導大鼠血栓形成模型來測定蝦肝素的抗血栓活性，實驗結果表明，巴西對蝦肝素具有與低分子量肝素相當的抗血栓形成活性。Gomes等[31]從一種軟體動物中提取出類肝素化合物，通過體內實驗證明，當劑量為1mg/kg時，該化合物能夠有效抑制光損傷動脈血栓的形成。
4.3抗炎作用
炎癥是由T淋巴細胞,抗體或非免疫組織的損傷引起的免疫識別開始的,免疫識別觸發了白細胞的激活、穿透和激素級聯放大系統從而引起的一系列反應統稱為炎癥。在炎癥反應過程中，選擇素通過與相應的配體結合介導白細胞與血管壁接觸，并使其在血管壁上滾動，最終導致白細胞在炎癥反應區域聚集，而肝素與相應的葡萄糖胺多糖能與選擇素分組結合，干擾自然配體的作用，從而抑制嗜中性粒細胞與活化的內皮細胞結合[32]。Gomes等[33]從一種軟體動物Nodipectennodosus中得到了一種肝素類似物，能抑制小鼠脂肪性腹腔炎所致的內皮細胞活化和炎癥細胞的聚集。Brito等[34]從凡納濱對蝦蝦頭中提取出了肝素，在急性炎癥模型中，除了能顯著減少炎癥細胞流入損傷部位外，還能降低炎癥動物腹腔灌洗液中基質金屬蛋白酶（MMPS）的活性。此外，該化合物具有較低的出血效應，可作為潛在的抗炎藥物。
4.4其他活性
肝素的結構是糖胺聚糖中最復雜的，與此相對應的是多樣的生物活性。除了上述提到的生物學功能，肝素還具有抗血管生成、抗腫瘤和抗平滑肌增殖等生物活性。Gomes等[33]從軟體動物Nodipectennodosus提取的肝素除了具有抗炎活性外，還具有抗腫瘤的作用，該物質通過抑制血管中血小板-腫瘤細胞復合體的形成，顯著地抑制肺癌細胞的轉移。Arumugam等[7]從青口和長硨磲中分離出具有抗增殖活性的肝素，通過肺動脈平滑肌細胞進行抗增殖試驗，結果表明青口肝素比長硨磲肝素的抗增殖活性更好。Dreyfuss[35]等報道從蝦頭中提取的肝素在激光誘導的CNV及體外模型中的抗血管生成作用，該化合物與生長因子（FGF-2、EGF和VEGF）結合，抑制內皮細胞增殖，可作為治療老年性黃斑病變的潛在藥物。
5展望
肝素具有復雜的結構及多樣的生物活性，在臨床上發揮了巨大作用，對肝素的研究必將會延續到新世紀。海洋生物源肝素作為傳統肝素的替代原料，具有副作用小，與人體細胞兼容性好的特點，但研究上仍有許多問題有待解決，如提取率不如陸地生物源肝素高，無法產業化生產；對其活性機制的研究還不夠透徹；未能掌握肝素特異結構與活性間的關系等。所以未來的研究重點應該包括（1）改進海洋生物源肝素的制備和合成，開發出更成熟的提取方法并最終實現產業化生產；（2）開發改進性能的肝素抗凝劑，可研究肝素產生某一副作用的分子量范圍，在制備中剔除那一分子量范圍的肝素，做到無副作用；（3）開發新的生物活性以及相應的藥物或保健品；（4）更新肝素原料庫，從更多的海洋生物中提取出肝素。從海洋生物中提取的肝素具有良好的組織結構和抗凝血活性，關于抗血栓、抗炎癥、抗血管生成等生物活性已有一些研究，但還有許多活性有待開發，海洋生物源肝素在天然產物藥物的開發和用于治療的新的衍生產品方面具有很大的潛力[36]。隨著科技發展，對其結構和活性的研究將會更深入，海洋肝素將有望實現產業化生產，開發出各種海洋保健品和藥品等，實現海洋生物資源的深入開發與利用。
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作者：杜振興1；周斯儀1；鐘賽意1,2,3；黃鳳嬌1；陳觀蘭1；陳菁1；洪鵬志1,3；章超樺1,3 單位：1.廣東海洋大學食品科技學院，2.廣東海洋大學深圳研究院，3.廣東省水產品加工與安全重點實驗室