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《環(huán)境科學(xué)與技術(shù)雜志》2014年第S1期

1國(guó)內(nèi)外海洋厭氧氨氧化研究進(jìn)展

1.1海洋厭氧氨氧化細(xì)菌研究

1.1.1厭氧氨氧化細(xì)菌種類海洋厭氧氨氧化細(xì)菌從分類學(xué)角度屬于浮霉菌綱中比較深的一個(gè)分支。盡管不同的Anammox菌的分類學(xué)距離較遠(yuǎn)，但是它們的生理學(xué)特性、新陳代謝和細(xì)胞結(jié)構(gòu)是相同的[6]。厭氧氨氧化菌為革蘭氏陰性球菌，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多呈彎月狀。Kuypers等在黑海發(fā)現(xiàn)了一種新的厭氧氨氧化菌，并定名為Candidatusscalindua，這是首次發(fā)現(xiàn)能將自然界中固定的無機(jī)氮直接去除的厭氧氨氧化菌[7]。目前為止，學(xué)者在自然界發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化細(xì)菌共有5種，分別為Candidatusbrocadia、Candidatuskuenenia、Candidatusscalindua、Candidatusanammoxoglobus和Candidatusjettenia，其中只有一屬Candidatusscalindua在所有調(diào)查的海洋中占統(tǒng)治地位，其他幾個(gè)屬都是在淡水中發(fā)現(xiàn)的[8]。而在研究工作中，學(xué)者很難在同一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中找到不同種的厭氧氨氧化細(xì)菌，不同的2個(gè)厭氧氨氧化菌種之間的分類學(xué)距離較遠(yuǎn)，說明每一種厭氧氨氧化菌占據(jù)完全不同的生態(tài)位[9]。此外中國(guó)近岸海區(qū)的厭氧氨氧化研究工作還在起步階段，中國(guó)海調(diào)查厭氧氨氧化細(xì)菌種類及生態(tài)分布將是海洋科技工作者未來重要工作任務(wù)。

1.1.2厭氧氨氧化細(xì)菌特征目前發(fā)現(xiàn)的海洋厭氧氨氧化細(xì)菌具有三大特征。（1）細(xì)菌細(xì)胞壁中缺乏肽聚糖，具有蛋白質(zhì)的S層，細(xì)胞壁上存在漏斗狀結(jié)構(gòu)。和所有已知的原核細(xì)菌細(xì)胞不同，浮霉?fàn)罹V中細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)很獨(dú)特，包含一個(gè)膜包圍的亞細(xì)胞空間稱為厭氧氨氧化體（Anammoxosome），可通過透射電鏡得到證實(shí)。這是厭氧氨氧化細(xì)菌的一種重要結(jié)構(gòu)特征。厭氧氨氧化反應(yīng)主要在該區(qū)域（Anammoxosome）內(nèi)進(jìn)行[10]。（2）厭氧氨氧化體膜上具有一種特殊的生物標(biāo)記———梯形脂（Ladderanelipids），這為鑒別厭氧氨氧化細(xì)菌提供了新的判斷依據(jù)[11]。這種梯形脂的作用是保護(hù)細(xì)胞可以免受厭氧氨氧化過程中有毒中間產(chǎn)物（N2H4）的毒害。Jaeschke等使用梯形脂作為生物標(biāo)記物研究了Irish和Celtic海大陸架沉積物中的厭氧氨氧化活動(dòng)，將出現(xiàn)完整的梯形脂作為檢測(cè)活體厭氧氨氧化細(xì)菌的直接證據(jù)，并將死體和活體細(xì)菌梯形脂的豐度進(jìn)行了比較[12]。（3）厭氧氨氧化細(xì)菌具有C型細(xì)胞色素，經(jīng)過富集培養(yǎng)厭氧氨氧化細(xì)菌表觀呈現(xiàn)深紅色，在468nm下有強(qiáng)烈吸收。經(jīng)過我們的實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C在氨氮和亞硝酸氮不足的情況下會(huì)迅速降低，而在重新供給氨氮和亞硝酸氮后細(xì)胞色素C又能很快恢復(fù)，其細(xì)胞色素C缺失和再生機(jī)制有待深入的研究。

1.1.3厭氧氨氧化細(xì)菌生長(zhǎng)厭氧氨氧化細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，倍增期長(zhǎng)達(dá)11d，且高細(xì)胞濃度時(shí)才具有活性，采用常規(guī)的微生物學(xué)方法難以進(jìn)行分離鑒定。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，Strous發(fā)現(xiàn)利用percoll密度梯度離心的方法可以獲得99.6%的厭氧氨氧化菌[13]。廢水處理廠的厭氧氨氧化細(xì)菌生長(zhǎng)最適宜的溫度為37℃，而海洋厭氧氨氧化細(xì)菌最適宜的溫度卻低得多，比如海底幾百上千米深處的溫度一般只有幾度到十幾度，甚至有些永久低溫區(qū)域溫度常年保持在-1℃以下，如Skagerrak海灣年平均溫度為4～6℃[14]。我們希望從海洋中富集培養(yǎng)厭氧氨氧化菌，從而可以深入地研究厭氧氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)特征。本實(shí)驗(yàn)室目前正在從渤海、黃海的沉積物中富集培養(yǎng)海洋厭氧氨氧化細(xì)菌。如何加快厭氧氨氧化菌的生長(zhǎng)速度，是目前將海洋厭氧氨氧化細(xì)菌應(yīng)用到含鹽廢水處理工藝中的關(guān)鍵問題，未來通過基因改造縮短生長(zhǎng)周期的方法可能解決該問題。

1.1.4厭氧氨氧化機(jī)理研究進(jìn)展1977年，Broda[3]根據(jù)熱力學(xué)反應(yīng)自由能計(jì)算，推測(cè)自然界中可能存在2種自養(yǎng)微生物將NH4+氧化成N2。1994年，Mulder等[1]發(fā)現(xiàn)荷蘭Delft大學(xué)一個(gè)污水脫氮流化床反應(yīng)器存在NH4+消失，且隨NH4+和NO3-的消耗，有N2生成。隨后的實(shí)驗(yàn)通過氮平衡和氧化還原平衡證實(shí)發(fā)生了以NH4+作電子供體、NO3-為電子受體的氧化還原反應(yīng)。從而證實(shí)了Broda的推測(cè)。1997年，vandeGraaf等通過15N標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化是以NO2-而不15N標(biāo)記實(shí)驗(yàn)還顯示羥胺和聯(lián)氨Anammox反應(yīng)的重要代謝中間產(chǎn)物，而且有少量的NO2-轉(zhuǎn)化為NO3-。羥胺可能來自NO2-，聯(lián)氨轉(zhuǎn)化為N2的過程被假定為給NO2-還原成羥胺提供電子。由NO2-生成NO3-可能是為了給厭氧氨化菌固定碳提供電子[5]。轉(zhuǎn)化過程中，通過氮平衡計(jì)算出NH4+和NO2-的去除，并且產(chǎn)生部分NO3-的比率為NH4+∶NO2-∶NO3-=1∶1.32∶0.26。同位素13C研究表明，Anammox菌利用相同的途徑來固定碳，可能是卡爾文循環(huán)和乙酰輔酶A途徑。

1.2國(guó)外海洋厭氧氨氧化研究

自1995年厭氧氨氧化現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)之后，各國(guó)學(xué)者對(duì)海洋厭氧海區(qū)沉積物中是否存在厭氧氨氧化活動(dòng)進(jìn)行了研究。2000年之前有關(guān)學(xué)者將海洋中氨氮的厭氧氧化過程歸因于海底錳氧化物的作用，但后來Thamdrup提出錳氧化物在海洋沉積物中對(duì)氨氮的厭氧氧化生成氮?dú)獾倪^程并不重要，同時(shí)認(rèn)為氨氮是富錳海區(qū)有機(jī)氮的最終礦化產(chǎn)物[15]。直至2002年，Thamdrup等發(fā)現(xiàn)在波羅的海過渡區(qū)的大陸架沉積物中，24%～67%的N2生成與厭氧氨氧化有關(guān)，首次報(bào)道了在海洋中存在厭氧氨氧化過程[16]。Dalsgaard等在哥斯達(dá)黎加GolfoDulce灣200m深處的缺氧水體中發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化活動(dòng)，采用15N元素示蹤技術(shù)定量研究了厭氧氨氧化活動(dòng)在海洋氮循環(huán)過程中的作用，發(fā)現(xiàn)由厭氧氨氧化過程產(chǎn)生的N2占到總N2產(chǎn)量的19%～35%[17]。Engstrom等在瑞典、挪威和美國(guó)近海沿岸的海洋沉積物中發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化活動(dòng)，7個(gè)站位厭氧氨氧化產(chǎn)生的N2占到總N2產(chǎn)生量的4%～79%[18]，進(jìn)一步證實(shí)了海洋厭氧氨氧化活動(dòng)在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用。此后人們開始了對(duì)海洋厭氧氨氧化活動(dòng)調(diào)控機(jī)理的研究，Trimmer提出了海洋厭氧氨氧化活動(dòng)是受沉積物中硝酸氮和亞硝酸氮的雙重調(diào)控的觀點(diǎn)，豐富了海洋厭氧氨氧化作用機(jī)理[14]。Woebken發(fā)現(xiàn)在Namibian近岸海洋上升流系統(tǒng)中的顆粒物與厭氧氨氧化活動(dòng)密切相關(guān)，并提出了顆粒物與厭氧氨氧化細(xì)菌的作用模型[19]。為了進(jìn)一步研究厭氧氨氧化與反硝化的相互作用，Jensen等研究了海洋沉積物厭氧氨氧化和反硝化的特異性抑制劑乙炔、甲醇和烯丙基硫脲的作用，為海洋沉積物厭氧氨氧化活動(dòng)與反硝化活動(dòng)的研究提供了有力的工具[20]。Rich等發(fā)現(xiàn)在Chesapeake灣及Choptank和Patuxent兩河入海口沉積物的厭氧氨氧化活動(dòng)具有顯著的差異，海灣沉積物厭氧氨氧化活動(dòng)占15%～20%，而河口的只有0～10%，這證明厭氧氨氧化速率與沉積物中NH4+濃度無關(guān)，而是與NO3-濃度和鹽度有關(guān)[21]。Jensen提出在丹麥的Mariager海灣氮?dú)猱a(chǎn)生的主要途徑是反硝化，厭氧氨氧化受到環(huán)境中硫酸鹽含量過低或環(huán)境波動(dòng)和厭氧氨氧化細(xì)菌本身生長(zhǎng)緩慢的影響而減弱[22]。隨后人們?cè)诖箨懠艹练e物、河流入海口沉積物、海洋厭氧水體都發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化活動(dòng)。不僅在歐洲[23]，亞洲的日本[24]、中國(guó)[8]及美洲的智利海域[25-26]均發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化活動(dòng)的存在，但是亞洲海洋的厭氧氨氧化研究還在起步階段，需要深入細(xì)致的研究。我國(guó)海洋厭氧氨氧化研究起步較晚，主要集中在海洋沉積物中的厭氧氨氧化生態(tài)學(xué)研究方面。穆春華等采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）研究了西太平洋深海沉積物微生物多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)在深海沉積物中存在浮霉菌，但未明確是否含有厭氧氨氧化細(xì)菌[27]。舒青龍等研究了南中國(guó)海沉積物中厭氧氨氧化微生物的多樣性，并獲得了厭氧氨氧化菌16SrRNA基因序列，證實(shí)了我國(guó)南海沉積物存在厭氧氨氧化細(xì)菌[28]。Strous等利用環(huán)境基因組學(xué)的手段解密了厭氧氨氧化細(xì)菌的進(jìn)化和新陳代謝過程，將厭氧氨氧化研究推進(jìn)到了分子水平，為進(jìn)一步研究海洋厭氧氨氧化細(xì)菌的代謝機(jī)理提供了很好的技術(shù)手段[29]。

1.3海洋厭氧氨氧化的研究方法

海洋水體、沉積物中的厭氧氨氧化活動(dòng)一般采用15N元素示蹤技術(shù)進(jìn)行研究[26]。首先需要先把原水樣或沉積物中的O2，有時(shí)甚至需要將NO3-、CO2、NO2-去除。然后準(zhǔn)備3種不同的標(biāo)記物，15NH4+，15NH4++14NO3-和15NO3-。經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)后，取產(chǎn)生的N2用同位素比例質(zhì)譜儀分析產(chǎn)生的N2中標(biāo)記的15N，可以判斷是否存在厭氧氨氧化活動(dòng)。然而，由于新近發(fā)現(xiàn)的某些厭氧氨氧化菌具有將硝酸鹽或亞硝酸鹽異化為氨的能力與反硝化過程效果相同，因此這種方法需要進(jìn)一步完善才能用于海洋厭氧氨氧化的研究。目前厭氧氨氧化細(xì)菌生態(tài)學(xué)研究還不夠深入，需要通過分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)手段進(jìn)行深入研究。現(xiàn)在主要應(yīng)用于厭氧氨氧化細(xì)菌檢測(cè)的主要分子生物學(xué)技術(shù)有：16SrRNA-PCR、16SrRNA-PCR-DGGE、16SrRNA-Realtime-PCR、基于16SrRNA和16S-23SrDNA間隔子序列的FISH技術(shù)等，這些分子生物學(xué)的方法為認(rèn)識(shí)海洋厭氧氨氧化細(xì)菌的多樣性、分布、進(jìn)化及定量分析提供了的技術(shù)基礎(chǔ)[27]。此外，目前研究海洋厭氧氨氧化細(xì)菌采用化學(xué)生物標(biāo)志物的方法，即根據(jù)厭氧氨氧化體膜上一種特殊結(jié)構(gòu)的梯形脂作為是否存在厭氧氨氧化細(xì)菌的依據(jù)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與同位素標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全一致，說明該方法具有很好的應(yīng)用前景。但是由于海洋沉積物或水體中厭氧氨氧化細(xì)菌豐度極低，分離提取梯形脂存在一定的難度。

1.4厭氧氨氧化的應(yīng)用研究

1.4.1厭氧氨氧化在海洋氮收支中的作用無機(jī)氮（NO3-、NO2-和NH4+）是世界很多海區(qū)初級(jí)生產(chǎn)力的主要限制因素[20]。海洋沉積物大都處于厭氧狀態(tài)，沉積物中的亞硝酸鹽和硝酸鹽一方面發(fā)生著反硝化的作用，另一方面氨氮和亞硝酸鹽發(fā)生著厭氧氨氧化反應(yīng)。最近的研究表明，造成海洋厭氧區(qū)域氮元素全部或大部分損失的原因是氨厭氧氧化（Anammox），而非傳統(tǒng)反硝化作用。因?yàn)?7%的海洋深度超過1000m，全球海洋平均深度為3800m，厭氧氨氧化在這些海區(qū)的氮循環(huán)中起著重要作用。因此，Dalsgaard認(rèn)為海洋氮循環(huán)中厭氧氨氧化脫氮能占到全球的N2產(chǎn)生量的1/3～2/3[17]。Ward等認(rèn)為，海洋中30%～50%的N2產(chǎn)出與厭氧氨氧化菌有關(guān)[6]。然而，Ward等提出了與先前不一致的觀點(diǎn)，認(rèn)為在阿拉伯海和南太平洋熱帶海區(qū)中主導(dǎo)固氮損失的是反硝化作用，而非氨厭氧氧化，在這一區(qū)域，反硝化細(xì)菌比厭氧氨氧化細(xì)菌更多，即使當(dāng)厭氧氨氧化速度很顯著時(shí)也是如此[9]。這項(xiàng)工作解決了我們對(duì)全球氮循環(huán)和固氮存量的認(rèn)識(shí)中一大不確定性問題，證實(shí)反硝化作用是整個(gè)海洋氮循環(huán)中的一個(gè)主要過程。盡管如此，厭氧氨氧化可能只是在個(gè)別海區(qū)的氮循環(huán)中占有一定的比例，厭氧氨氧化和反硝化在產(chǎn)氮中的重要性是由各自底物的減少來調(diào)控的。鑒于目前全球還有很多海區(qū)未開展厭氧氨氧化的研究，因此還無法對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌在全球氮循環(huán)中的影響作出準(zhǔn)確的評(píng)估。因此對(duì)全球海洋厭氧氨氧化活動(dòng)的分布，以及在氮循環(huán)中的貢獻(xiàn)率還有待在更多的海區(qū)開展調(diào)查研究。

1.4.2海洋厭氧氨氧化菌在廢水處理中的應(yīng)用對(duì)于海洋厭氧氨氧化細(xì)菌的工程化應(yīng)用研究還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室目前正在從事將海洋厭氧氨氧化細(xì)菌應(yīng)用于低C/N比的含鹽廢水的生物脫氮生物反應(yīng)器的啟動(dòng)、性能及影響因素的研究，并取得了一定的成果。由于海水具有的天然鹽度，這使得眾多學(xué)者意識(shí)到如果將海洋中的厭氧氨氧化細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)，用于處理低C/N比的含鹽廢水有很好的市場(chǎng)前景。但是由于海洋中厭氧氨氧化細(xì)菌豐度極低，很難進(jìn)行富集培養(yǎng)。近幾年有些學(xué)者進(jìn)行了成功的探索。Nakajima等將無紡布填料放在海底富集厭氧氨氧化細(xì)菌3個(gè)月，之后將該填料放入柱型反應(yīng)器中，在實(shí)驗(yàn)室條件下經(jīng)過1a的時(shí)間成功啟動(dòng)了海洋的厭氧氨氧化生物反應(yīng)器[30]。Vossenberg等使用海底表層2cm的沉積物作為接種物，以海鹽配置人工海水，經(jīng)過10個(gè)月在實(shí)驗(yàn)室成功啟動(dòng)了厭氧氨氧化反應(yīng)器，富集的厭氧氨氧化細(xì)菌純度達(dá)到90%[31]。Takehiko等采用含鹽廢水污水處理廠的活性污泥，啟動(dòng)了海水性的厭氧氨氧化生物反應(yīng)器，該厭氧氨氧化反應(yīng)器用于處理高鹽高氨氮地下鹽鹵水，處理負(fù)荷達(dá)到了1.6kg（/m3•d）[32]。Yasunori等將海洋廢水處理廠沉積物獲取的厭氧氨氧化細(xì)菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，經(jīng)過150～250d脫氮效率達(dá)到80%，氮負(fù)荷達(dá)到了0.4kg（/m3•d）[33]。從目前的研究現(xiàn)狀來看，以海洋沉積物作為接種污泥啟動(dòng)海水厭氧氨氧化生物反應(yīng)器過程長(zhǎng)，要求條件高，即使啟動(dòng)成功其NH4+和NO2-去除效率也顯著低于用活性污泥啟動(dòng)的淡水厭氧氨氧化生物反應(yīng)器。筆者所在的實(shí)驗(yàn)室利用渤海灣海洋沉積物作為接種污泥經(jīng)過6個(gè)月的時(shí)間成功啟動(dòng)了含鹽廢水的海洋厭氧氨氧化生物反應(yīng)器，目前如何快速啟動(dòng)海洋性厭氧氨氧化生物反應(yīng)器以及大幅度提高其性能是未來研究的熱點(diǎn)。

1.4.3海洋厭氧氨氧化與淡水厭氧氨氧化比較（1）相同點(diǎn)。Anammox細(xì)菌在海水淡水環(huán)境中都存在，這可能是由于河口是海陸作用最為劇烈、生態(tài)結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的區(qū)域之一，同時(shí)也是環(huán)境壓力最為嚴(yán)重、污染類型最為豐富的區(qū)域，致使河口區(qū)域環(huán)境梯度變化較大，能夠營(yíng)造適合不同種類anammox菌生存的微環(huán)境。目前認(rèn)為，河口環(huán)境是anammox菌種群多樣性水平最高的區(qū)域之一。（2）不同點(diǎn)。一是由于淡水中有機(jī)物含量較高，Anammox細(xì)菌豐度較海洋沉積物中的要高；二是海洋中的Anammox細(xì)菌主要是Scalindua屬的Anammox菌占主導(dǎo)地位，淡水中淡水底泥中Brocadia和Kuenenia屬的Anammox菌明顯占優(yōu)[34]。

2研究展望

近年來隨著對(duì)海洋厭氧氨氧化研究的深入，研究的方法和手段取得了很大的進(jìn)步，但是還存在很多需要解決的問題。目前我們對(duì)海洋厭氧氨氧化的了解還是建立在廢水處理系統(tǒng)中厭氧氨氧化的研究基礎(chǔ)上的。海洋厭氧氨氧化作用機(jī)理已取得了初步認(rèn)識(shí)，但海洋厭氧氨氧化具有自身的特殊性，因此不能完全利用水處理領(lǐng)域獲得的知識(shí)來開展海洋厭氧氨氧化的研究。未來海洋厭氧氨氧化活動(dòng)研究應(yīng)就海洋厭氧氨氧化細(xì)菌的生態(tài)學(xué)展開研究，明確其生態(tài)條件，進(jìn)而便于預(yù)測(cè)全球海洋厭氧氨氧化活動(dòng)的分布。在東太平洋地區(qū)近海大陸架區(qū)域由于工農(nóng)業(yè)污水的排放、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的耗氧有機(jī)物使得局部海區(qū)出現(xiàn)缺氧，因此這些海區(qū)的厭氧氨氧化細(xì)菌種群類型、分布特征、主要影響因素的研究亟待加強(qiáng)。因此，未來海洋厭氧氨氧化應(yīng)加強(qiáng)以下幾方面的研究：（1）中國(guó)海洋厭氧氨氧化研究起步晚，中國(guó)的學(xué)者近幾年開始了對(duì)南中國(guó)海沉積物厭氧氨氧化活動(dòng)的調(diào)查研究，而對(duì)于中國(guó)其它海區(qū)如東海、黃海和渤海開展的厭氧氨氧化研究還不多。（2）繪制全球范圍海洋厭氧氨氧化活動(dòng)分布圖，以及準(zhǔn)確評(píng)價(jià)海洋厭氧氨氧化在全球海洋氮循環(huán)中的重要作用對(duì)完善海洋氮的生物地球化學(xué)循環(huán)具有十分重要的意義。（3）利用海洋厭氧氨氧化細(xì)菌的耐鹽性，用于低C/N含鹽廢水的生物脫氮。我國(guó)北方黃渤海地區(qū)特別是一些海灣地區(qū)，存在很多厭氧區(qū)域，并且富營(yíng)養(yǎng)化較為嚴(yán)重，在這樣的生態(tài)環(huán)境中厭氧氨氧化研究具有重要意義。

作者：魏海峰周集體喬森劉遠(yuǎn)單位：大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院