納米凝膠的體內外釋藥規律范文

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《世界中醫藥雜志》2015年第一期

1材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠，雄性，體重為200～250g。由新華醫院實驗動物中心提供，生產許可證號:SCXK(滬)2002－0010;使用許可證號:SYXK(滬)2003－0031。適應性飼養7d。

1.2試劑和儀器溫敏型辛夷納米凝膠，自制;洛沙姆407(P407/F127)/泊洛沙姆188(P188):BASF公司;AgilentTechnologies1200系列高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司;InertsilODS-3柱(250mm×4.6mm，5μm):Dikma公司;半透膜(截留分子量7000μ)，上海源聚生物科技有限公司;Franz擴散池，上海黃河儀器儀表廠有限公司。

1.3方法

1.3.1體外釋藥模式的考察本實驗采用Franz擴散池法。在兩池間固定半透膜(截留分子量為7000μ)，溫敏液約1mL，使其均勻分布在半透膜表面，放入33℃烘箱中5min使其形成凝膠。將擴散池放入33℃水浴中，往接收池中加入己預熱至33℃的無水乙醇5mL作為接收液，接收池中置一攪拌子以300r/min的轉速轉動，分別于5min、10min、20min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h分別取樣1mL，而后迅速補加等量預熱的無水乙醇。樣品必要時適當稀釋使濃度在標準曲線的范圍內，采用HPLC法測定。

1.3.2在體鼻腔吸收規律的考察1)實驗動物模型及裝置:選擇體重在250g左右的健康雄性大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉2.5mL/kg。麻醉后切開頸部，暴露氣管和食管，向氣管中插入聚乙烯套管，用相同直徑的鼻腔套管由食管插向鼻腔后部，將口、鼻腔相連的鼻腭進行封閉，防止藥液從口腔流出。用橡膠管與插入大鼠鼻腔后部的套管相連，管子的另一端與清洗液(生理鹽水)接觸，將盛有生理鹽水的容器置于約4℃的冷水浴中。本實驗中采用單側鼻腔給藥的方式，另一鼻孔用502膠封閉。給藥后，藥物在鼻腔中滯留一定時間，用電子蠕動泵使生理鹽水從鼻孔中將藥液沖出，收集清洗液，用HPLC法測定其中含藥量。2)在體鼻腔清洗液用量的考察:為了考察洗凈鼻腔內殘留藥物需用的清洗液量，向一側鼻孔注入溫敏溶液20μL，待形成凝膠后，立刻由鼻腔套管以2mL/min的流速灌注生理鹽水。經多次試驗表明，至少需要5mL的清洗液，才可達到93%以上的回收率。所以鼻腔內殘留藥物需用的清洗液量為5mL以上，本實驗選擇清洗液體積為6mL。3)鼻腔清洗液的收集和測定:單側鼻腔給予溫敏液10μL，待凝膠形成后，用6mL清洗液以2mL/min流速沖洗大鼠鼻腔，取滯留時間為10min、15min、20min、30min、60min、120min的清洗液，補加生理鹽水至6mL。采用HPLC法測定，以外標法計算含量，即為溫敏凝膠的殘余量，吸收藥量=給藥量－殘留藥量。

1.3.3高效液相色譜方法的建立1)色譜條件的選擇:用氣相色譜－質譜法對辛夷揮發油化學成分進行分析，共鑒定出30個成分，占揮發油成分的81%以上，主要包括桉油精、樟腦、α-蒎烯等。本實驗選用樟腦作為對照品，建立HPLC法測定藥物含量。圖1樟腦的紫外圖譜2)檢測波長的選擇:根據《中華人民共和國藥典2005年版(二部)》，紫外－可見分光光度法鑒別樟腦，在230～350nm的波長范圍內測定吸光度，在289nm有最大吸收。配制濃度為0.904mg/mL的樟腦溶液在200～400nm波長范圍內進行紫外掃描。結果見圖1。經多次掃描結果表明，樟腦的最大吸收波長為(202±1)nm。雖然202nm為末端吸收，但靈敏度較高，其吸光度約為289nm的8倍左右，所以波長選擇203nm。色譜條件如下:色譜柱:InertsilODS-3柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相:乙腈∶水(80∶20)，檢測波長:203nm，流速:1.0mL/min，柱溫:室溫，進樣量:5μL。在上述色譜條件下分別測定樟腦、鼻腔分泌物溶液及含有溫敏型辛夷納米凝膠的鼻腔分泌物溶液的色譜圖，見圖2－圖4。圖2為樟腦溶液色譜圖，圖4為含有溫敏型辛夷納米凝膠的鼻腔分泌物溶液的色譜圖，由圖可見，鼻腔分泌物對溫敏型辛夷納米凝膠的測定沒有干擾。3)標準曲線的繪制:精密稱取樟腦對照品9.04mg置于10mL量瓶中，加入無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4mL，分別置于2mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻配成不同濃度的溶液。按照HPLC法進行測定，以樟腦峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行線性回歸，繪制標準曲線，得回歸方程y=431.927x－9.99，R2=0.09998。結果表明在濃度0.09～0.63mg/mL范圍內，峰面積與濃度具有較好的線性關系，結果見圖5。1.5統計學方法采用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，實驗數據以(珋x±s)表示，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1溫敏型辛夷納米凝膠的體外釋藥考察采用Franz擴散池法研究溫敏型辛夷納米凝膠的體外釋放情況。計算累積釋放量，見表1。由累積釋放率對時間作圖即可得體外釋放曲線，進一步擬合找出釋放規律。從試驗結果來看，溫敏型辛夷納米凝膠釋藥模式具有分段性，前30min符合Higuchi方程，以擴散過程為主，可能的原因是這段時間少量游離的辛夷油率先擴散到外面溶液中。30min后呈現零級釋藥模式，說明此時的凝膠可以連續穩態釋藥，辛夷油通過凝膠的控釋作用釋放，成為整個辛夷油釋藥的限速步驟。溫敏型辛夷納米凝膠12h累積釋放率為14%。將溫敏型辛夷納米凝膠在4℃條件下密封儲存，平均分成4份，分別在不同時間考察其釋藥模式，結果發現避光、密封于4度冰箱條件下儲存1周、2周、1個月的樣品和新制備的樣品相比釋藥模式無明顯變化。見表2。

2.2在體鼻腔吸收規律研究采用動力學模型處理，結果表明溫敏型辛夷納米凝膠的吸收符合一級動力學過程，表明其具有緩釋效應。

3討論

變應性鼻炎(AllergicRhinitis，AR)是由免疫球蛋白(IgE)介導通過釋放組織胺或其他化學活性物質誘發的鼻黏膜I型變態反應［4］。目前缺少有效的治療藥物，特別是兒童變應性鼻炎患者，西醫治療的一線藥物是鼻用糖皮質激素和抗組胺藥物，雖然鼻用激素在治療AR中的療效確切，但并不能治愈AR，而且停藥后有反跳現象，特別是長期讓患兒使用其累積的不良反應不可忽視［5］。中醫藥治療變應性鼻炎具有療效顯著、不良反應較少的特點。辛夷是治療變應性鼻炎的常用藥物，具有祛風通竅的作用，其有效成分為揮發油，具有廣泛的抗過敏藥理活性［6］。納米脂質體是以磷脂為主要材料制成的具有生物膜結構的雙分子囊［7］，是一種新型的鼻腔給藥載體。前期研究已經成功制備出辛夷揮發油納米脂質體，既保持了辛夷的藥理活性，又具備普通揮發油制劑沒有的優勢［8］。辛夷納米脂質體生物相溶性好，脂質雙分子層與生物膜有較大的相似性與組織相溶性，易于被組織吸收，可減少對鼻黏膜的毒性和刺激［9］;其次，納米脂質體保護藥物不被鼻腔黏液中的酶降解，并且持續釋放包封藥物，達到長效緩釋的作用［10］。但是液態脂質體的貯存穩定性較差。在貯存過程中極易發生團聚、融合及藥物滲漏［11］，且主要膜材磷脂易氧化、水解，難以滿足藥物制劑穩定性的要求，同時由于溫度、光線等影響產生乳析、凝聚、融合、粒徑變大等現象，這些變化都對脂質體的應用產生負面的效應，使應用受到了很大限制。為此，必須采用適當的方法來處理液態脂質體來提高其貯存穩定性。低溫冷凍干燥技術［12］是提高蛋白、藥物等生物活性物質和聚合物藥物等體系貯存穩定性的有效手段。

制成的凍干脂質體可顯著降低磷脂和藥物的水解和氧化速度，同時，凍干保護劑也保持了脂質體膜結構的完整性，克服脂質體聚集、融合及藥物滲漏等不穩定因素［13］，顯著提高貯存穩定性。目前，該法已成為改善脂質體制劑長期穩定性的方法之一。臨床治療中亦發現，常用的滴鼻液由于鼻纖毛的清除功能，藥物在鼻黏膜上停留時間短，僅有15～30min［14］。因此在一定程度上影響了藥物的吸收和療效，且鼻腔容積較小，給藥劑量有一定限制［15］。凝膠劑用于鼻腔給藥，具有一定的緩釋作用，能使藥物緩慢持續地被釋放，增加了藥物與鼻黏膜的接觸時間［16］。

但是由于凝膠劑型質地黏稠，不易使凝膠藥物進入鼻腔［17］。如能將藥物的易于給藥性和凝膠劑的緩釋性相結合，將會大大提升藥物的生物利用度。因此我們創新性地制備溫敏型辛夷納米凝膠，通過溫敏凝膠的控緩釋系統，進一步提高辛夷揮發油的生物利用度。本實驗中通過體外釋藥實驗研究溫敏型辛夷納米凝膠的控緩釋性。研究結果顯示12h累積釋藥率為14%，表明該溫敏制劑具有明顯的控緩釋作用。采用大鼠在體鼻腔滯留法考察溫敏型辛夷納米凝膠的鼻腔吸收規律，結果顯示符合一級動力學方程，表明該制劑具有緩釋效應。揮發油類中藥占中藥類的35%左右［18］，但因其易揮發、不穩定、刺激性大等缺點限制了臨床的應用。我們應用現代納米技術制備納米中藥，使其便于應用、貯存、運輸，并且經過研究證明納米尺度效應可顯著提高藥物療效。但是，納米技術既是現在臨床研究的熱點也是難點，我們雖然已經取得了一定的成果，但本課題缺少臨床藥效學和毒理研究，應在后續研究中進一步展開，以便于應用臨床。

作者：張欣吳敏閻秀菊馬博單位：上海交通大學醫學院附屬新華醫院中醫科