自身免疫性肝病的抗體檢測(cè)范文
本站小編為你精心準(zhǔn)備了自身免疫性肝病的抗體檢測(cè)參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫(xiě)作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。
《臨床檢驗(yàn)雜志》2014年第六期
1．1PBC2009年AASLD與2010年歐洲肝病研究學(xué)會(huì)(EuropeanAssociationFortheStudyoftheLiver，EASL)推薦的PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)［6-7］:(1)存在膽汁淤積的生化學(xué)證據(jù)，主要是堿性磷酸酶(ALP)升高;(2)抗線粒體抗體(AMA)陽(yáng)性;(3)組織學(xué)上存在非化膿性破壞性膽管炎以及小葉間膽管破壞的表現(xiàn)。滿足以上3條標(biāo)準(zhǔn)中的兩條即可診斷PBC。1965年Walker等用IIF技術(shù)發(fā)現(xiàn)PBC患者血清中存在AMA，是PBC的標(biāo)志性自身抗體，特別是AMA-M2亞型陽(yáng)性對(duì)PBC的診斷具有高度敏感性和特異性，其陽(yáng)性率達(dá)90%～95%。AMA-M2亞型的靶抗原為線粒體上2-氧酸脫氫酶復(fù)合體(2-OADC)的一些成分。2-OADC包括丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞單位(PDC-E2)、支鏈二酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞單位(BCOADC-E2)、2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體E2亞單位(OGDC-E2)以及二氫硫辛酰胺脫氫酶結(jié)合蛋白(E3BP)，最常見(jiàn)的反應(yīng)是針對(duì)PDC-E2。AMA陰性也不能完全排除PBC的患病可能，約5%～10%的患者中AMA陰性，但其臨床表現(xiàn)與AMA陽(yáng)性患者相同。此外，研究表明AMA與疾病的進(jìn)展不相關(guān)［8］。除了AMA，50%左右的PBC患者也能檢測(cè)到ANA陽(yáng)性，其常見(jiàn)熒光模式包括斑點(diǎn)型、多核點(diǎn)型、核周型和抗著絲粒型。一般認(rèn)為，多核點(diǎn)型ANA和核周型ANA具有PBC疾病相關(guān)性。多核點(diǎn)型ANA的靶抗原是核體復(fù)合物，主要包括Sp100、早幼粒細(xì)胞性白血病(PML)抗原、微小泛素相關(guān)修飾因子(SUMO)以及新近確定的Sp140。核周型ANA的靶抗原是核孔復(fù)合物和核膜，其中，核孔復(fù)合物主要包括gp210和p62，核膜蛋白是核纖層蛋白B受體(LBR)。抗gp210、抗Sp100抗體可以作為判斷預(yù)后好壞的一種特異性標(biāo)志物［9］。
1．2PSCAASLD于2010年的《PSC診療指南》［10］中建議:出現(xiàn)ALP和γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)升高等膽汁淤積生化特征，膽管造影檢查包括磁共振膽管造影(MRC)、內(nèi)鏡逆行膽管造影(ERC)、經(jīng)皮肝穿刺膽管造影(PTC)等顯示具有典型的多灶性膽管狹窄和節(jié)段性擴(kuò)張的膽管改變，并除外繼發(fā)性硬化性膽管炎，則可以診斷為PSC。PSC組織學(xué)改變?yōu)榇蟆⒅行湍懝軓浡匝装Y和膽管周?chē)把笫[波”樣纖維化，膽管閉塞、膽汁淤積、膽管減少。PSC患者會(huì)出現(xiàn)高球蛋白(IgG、IgM)血癥，血清中ALT、AST、膽紅素上升。大部分PSC患者非典型pANCA陽(yáng)性。但PBC和AIH患者中也有非典型pANCA的出現(xiàn)，因此pANCA陽(yáng)性不能作為PSC的特異性確診指標(biāo)［11］。
2自身免疫性肝病的抗體檢測(cè)技術(shù)
2．1IIF法IIF使用具有較大核仁細(xì)胞的組織或者HEp-2細(xì)胞作為抗原來(lái)源，用于細(xì)胞內(nèi)抗原定位或相應(yīng)抗體(如ANA、AMA、ASMA、抗LKM-1等)檢測(cè)，是研究自身免疫性肝病使用最為廣泛的方法。該方法能夠區(qū)別不同熒光類(lèi)型，特異性較高。但手工操作及人工判讀結(jié)果均存在主觀誤差。雖然某些IIF自動(dòng)稀釋系統(tǒng)和判讀系統(tǒng)已經(jīng)上市，但其標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化進(jìn)程仍然落后于其他實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。一些研究者認(rèn)為免疫熒光技術(shù)已經(jīng)過(guò)時(shí)，可以用酶免疫分析或其他試驗(yàn)技術(shù)來(lái)取代［12］。但是，因?yàn)槠淇贵w譜全面和能夠發(fā)現(xiàn)未知抗體，IIF仍然是掃描自身免疫疾病抗體ANA的推薦方法。ANA由于包括了多種針對(duì)不同抗原的抗體，底物特異性相對(duì)較差。IIF實(shí)驗(yàn)主要基于手工操作，結(jié)果判斷人為因素較大，容易造成結(jié)果判斷的個(gè)人差異和室間差異。由于ANA缺少疾病特異性，將來(lái)會(huì)更多地應(yīng)用于常規(guī)普查。對(duì)于特異疾病的診斷，ANA的檢測(cè)會(huì)逐步被針對(duì)特異抗核蛋白或DNA的抗體檢測(cè)所替代。
2．2ELISA20世紀(jì)90年代后期，開(kāi)發(fā)了商業(yè)ANA酶免疫分析(EIA)法檢測(cè)試劑盒，但因未獲得與IIF相同的檢測(cè)結(jié)果而未被廣泛使用。近年新型商品ANA-EIA試劑盒通過(guò)使用含有純化或重組抗原的HEp-2細(xì)胞核提取物作為底物，達(dá)到了很高的敏感性和較高陰性預(yù)測(cè)值。針對(duì)AMA檢測(cè)的ELISA方法，早期以PDC-E2為底物。為提高AMA-M2檢測(cè)的敏感性，一些AMA檢測(cè)方法加入以丙酮酸脫氧化氫酶復(fù)合物中3個(gè)脫氫酶的C端連接組成的重組蛋白質(zhì)作為底物。ELISA法與IIF相比，以吸光度(A)值代替滴度，以特異性抗體取代熒光模式，酶標(biāo)記試劑相對(duì)穩(wěn)定，且無(wú)放射性危害，相對(duì)而言，結(jié)果更客觀，操作快捷、易于自動(dòng)化［13］。目前臨床檢測(cè)自身免疫肝病抗體的ELISA和免疫印跡法(膜條)的產(chǎn)品之間存在著較大的底物差異，這可能是不同產(chǎn)品之間結(jié)果出現(xiàn)差異的原因之一。
2．3免疫印跡膜條法免疫印跡膜條法是通過(guò)將特定抗原固化在膜條的特定位置，以待檢血清或血漿樣品為第一抗體的免疫印跡檢測(cè)方法。膜條上的抗原多為重組蛋白質(zhì)，經(jīng)親和層析分離純化，部分抗原為合成多肽。因?yàn)榭乖兌容^高，免疫反應(yīng)特異性也較強(qiáng)。由于可在膜條的不同位置分別固化不同特定抗原，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種自身抗體的檢測(cè)，結(jié)果判斷也較為簡(jiǎn)單。目前此方法的大部分實(shí)驗(yàn)過(guò)程可實(shí)現(xiàn)儀器操作，結(jié)果的判定也可根據(jù)不同公司研發(fā)的軟件進(jìn)行自動(dòng)判斷。基于該方法的自身免疫肝病抗體檢測(cè)膜條已廣泛被國(guó)內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室所采用。2．4xMAP微珠法自Luminex公司研制出基于兩種熒光組合的微珠技術(shù)(xMAP)以來(lái)，其在臨床檢測(cè)上的應(yīng)用受到越來(lái)越多的重視。微珠制備是通過(guò)采用
橘紅兩色熒光素按比例混合于聚苯乙烯微珠中，產(chǎn)生100種可通過(guò)激光識(shí)別的熒光微珠。針對(duì)不同的熒光微珠耦聯(lián)特定抗原，結(jié)合流式計(jì)數(shù)，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)針對(duì)多種自身抗體的檢測(cè)。Rouquete等［14］采用這一方法對(duì)9種核抗原耦聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)9種不同抗核抗體的檢測(cè)。目前已有多家公司采用這一技術(shù)研發(fā)了針對(duì)自身免疫性肝病抗體的檢測(cè)產(chǎn)品。采用xMAP微珠法，由于同時(shí)對(duì)多種抗體進(jìn)行分析，抗原抗體交叉反應(yīng)所造成的假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果會(huì)比采用單一抗原的ELISA或分別點(diǎn)樣的膜條要高。但由于抗原抗體結(jié)合過(guò)程是在懸液中進(jìn)行的，比之ELISA和膜條方法，xMAP微珠法的抗原抗體結(jié)合更加有效。由于xMAP微珠法檢測(cè)指標(biāo)組合的靈活性和多抗體的同時(shí)檢測(cè)，這一方法將會(huì)被更多的臨床實(shí)驗(yàn)室采用。
3自身免疫性肝病抗體檢測(cè)存在的問(wèn)題
自身免疫性肝病抗體的檢測(cè)目前主要存在兩大問(wèn)題。其一就是抗體檢測(cè)底物的非均一性。以AMA-M2檢測(cè)產(chǎn)品為例，現(xiàn)有ELISA和膜條印跡法的AMA-M2抗原有組織提取物、PDC-E2全長(zhǎng)重組蛋白、PDC-E2的N端重組蛋白、PDC-E2/BCOADC-E2/OGDC-E2N端三聯(lián)體融合重組蛋白和PDC-E2/BCOADC-E2/OGDC-E2全長(zhǎng)重組蛋白混合物。抗gp210抗體檢測(cè)采用的抗原有來(lái)自大腸埃希菌的重組蛋白、昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9表達(dá)的重組蛋白和合成多肽。因抗原不同，檢測(cè)敏感性和檢出率會(huì)產(chǎn)生較大差別。自身免疫性肝病自身抗體檢測(cè)存在的另一主要問(wèn)題就是缺少統(tǒng)一的檢測(cè)質(zhì)控品和陽(yáng)性對(duì)照。1982年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)和美國(guó)疾病控制中心通過(guò)收集ANA陽(yáng)性患者血清，建立了5個(gè)不同的ANA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展為10個(gè)不同的ANA檢測(cè)血清標(biāo)準(zhǔn)品。這10個(gè)血清標(biāo)準(zhǔn)品包括不同的ANA特異性(非變性DNA，SS-A，SS-B，U1-RNP，Sm，Sc1-70和Jo-1)［15］。1988年世界衛(wèi)生組織和國(guó)際免疫學(xué)協(xié)會(huì)聯(lián)盟(IUIS)開(kāi)始從患者血清制備了3種ANA標(biāo)準(zhǔn)品，包括WHO66/233(IgG類(lèi)ANA)和W0/80(抗雙鏈DNA抗體)。目前歐盟的相關(guān)機(jī)構(gòu)亦有將少量自身免疫抗體陽(yáng)性的患者血清用作標(biāo)準(zhǔn)品。所有這些標(biāo)準(zhǔn)品的來(lái)源均來(lái)自于個(gè)別患者血清，數(shù)量有限，無(wú)法提供給臨床實(shí)驗(yàn)室用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控。由于缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品和校正品，目前市場(chǎng)上基于ELISA的自身免疫抗體檢測(cè)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的校正單純基于采用調(diào)整第二抗體(抗人IgG類(lèi)抗體)來(lái)進(jìn)行。產(chǎn)品本身的校正各公司均采用任意單位(由于無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品)，造成結(jié)果無(wú)法比較。多數(shù)試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照無(wú)明確說(shuō)明，其來(lái)源和性質(zhì)未知。
4結(jié)語(yǔ)
自身免疫性肝病是一類(lèi)慢性進(jìn)展性疾病，嚴(yán)重影響患者肝臟功能，目前不可治愈，因此早期診斷和藥物干預(yù)對(duì)控制疾病的發(fā)展極為重要。相關(guān)自身抗體的檢查在自身免疫性肝病的診斷上尤為重要。今后幾年的發(fā)展重點(diǎn)將會(huì)針對(duì)相關(guān)抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化研究和檢測(cè)質(zhì)控品的開(kāi)發(fā)。
作者：劉向東單位：東南大學(xué)生命科學(xué)研究院