嗜吞噬細胞無形體的分子檢測范文

本站小編為你精心準備了嗜吞噬細胞無形體的分子檢測參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《臨床檢驗雜志》2014年第六期

1診斷方法

1．1形態(tài)學診斷AP感染人和易感動物后，主要侵染成熟或未成熟的髓系白細胞。取可疑患者末梢血作厚、薄血涂片，經(jīng)吉姆薩染色，于中性粒細胞胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)多個無形體緊密堆積在一起形成桑葚樣包涵體(morulaeelementarybody)可支持診斷。形態(tài)學診斷方法對采血時間要求嚴格，且診斷者要有較豐富的看片經(jīng)驗，否則容易發(fā)生漏診和誤診。

1．2血清學診斷通過檢測患者血清中抗AP的IgM和IgG類抗體水平及升高程度，可特異性診斷HGA。常用方法為間接免疫熒光(immunofluorescenceassays，IFA)法。采集急性期(發(fā)熱初期，一般發(fā)病1周內(nèi))與恢復(fù)期(至少間隔2～3周)雙份血清。如恢復(fù)期血清抗體檢測陰性，應(yīng)建議醫(yī)生采集第3份血液樣本(間隔2～4周)。如果同時檢測雙份血清，IgG抗體4倍升高，則結(jié)果強烈支持AP感染。如果急性期抗體升高，而恢復(fù)期沒有升高或輕微升高，則應(yīng)采集第3份血液樣本(間隔2～4周)進行進一步檢測。血清學診斷方法準確，特異性高，但由于抗體出現(xiàn)較晚，診斷所需時間較長，故血清學檢測無法在早期對HGA進行診斷［3］。

1．3分離培養(yǎng)病原體多用人白血病細胞系HL60進行AP的分離培養(yǎng)。最常用的分離方法是將白細胞部分接種培養(yǎng)基，然后將100～500μL抗凝血接種到2×105或1×106個懸浮細胞內(nèi)，每2～3d染色檢查包涵體，一般5～10d可查見包涵體。從患者血標本中分離AP是確診該病最可靠的方法，但細胞培養(yǎng)分離AP方法復(fù)雜和耗時，而且成功率不高。最終確認依然需要檢測AP特異性核酸。

1．4分子檢測方法AP感染可通過檢測AP的DNA進行診斷，AP的分子生物檢測方法可用于感染急性期的診斷，或用于后期病原體培養(yǎng)物的鑒定。分子檢測診斷方法具有較高敏感性、特異性和可重復(fù)性，而且診斷快速、操作簡單。

2AP分子檢測技術(shù)

AP分子檢測技術(shù)可用于對可疑患者血清樣本進行檢測，亦可對細胞培養(yǎng)后血細胞標本進行檢測，同時也用于AP傳播媒介－蜱的基因分子檢測和分類。AP的基因組由單股環(huán)狀染色體構(gòu)成，長度為1471282bp，G+C百分比為41．6%，含有1369個開放讀碼框(ORF)。其特征性基因為外膜蛋白(majorsurfaceprotein，msp)以及ankA基因，100%的菌株具有msp2基因，70%的菌株具有ankA基因。目前AP分子檢測常用的目標包括編碼16SrRNA、熱激蛋白(heat-shockprotein，groESL)、msp蛋白、AnkA蛋白等的基因。16SrRNA高度保守，是PCR檢測最常擴增的靶基因，熱激蛋白基因groESL擴增雖不如16SrRNA應(yīng)用廣泛，但groESL基因在不同種屬間具有較大的變異性，因此，對于診斷及菌株的鑒定有重要意義;msp編碼AP特征性外膜蛋白，這種蛋白質(zhì)主要介導(dǎo)AP與不同宿主細胞間相互作用，并保證AP能更快地進入宿主細胞內(nèi)。由于AP的宿主范圍很廣，包括多種脊椎動物和非脊椎動物，所以msp在不同來源的AP之間差異性大。其中msp2作為AP主要特征性外膜蛋白，已作為診斷AP感染的指征;ankA編碼的錨定蛋白能夠介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的作用，因此AnkA在不同宿主間表現(xiàn)出多樣性［5］。目前ank基因鑒定通常用于msp2陽性病例基礎(chǔ)上，進行種屬分型［6］。AP感染的分子生物學診斷方法主要包括巢式PCR(nestedPCR)、實時定量熒光PCR(realtimePCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)等。PCR和PCR相關(guān)檢測技術(shù)是診斷AP感染的常規(guī)方法，目標基因與PCR引物見表1。

2．1巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是一種變異的PCR，使用兩對(而非一對)PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物(因其在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增產(chǎn)物。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片段，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR檢測可提高檢測靈敏度和特異性，通常采用屬特異和種特異引物同時進行檢測。PCR檢測應(yīng)分區(qū)進行，避免污染。16SrRNA高度保守，是巢式PCR檢測AP最常擴增的靶基因。由于AP的地域分布范圍廣，且有高度的生物學和臨床學多樣性，在比較不同地域發(fā)現(xiàn)的AP時最常用的方法就是巢式PCR。例如在波羅地海與挪威發(fā)現(xiàn)的AP比較研究就是用巢式PCR對16SrRNA和msp4進行測序分析［16］。Wuri-tu等用巢式PCR比較日本發(fā)現(xiàn)的AP與美國和歐洲AP的P44/msp2基因結(jié)構(gòu)。熱激蛋白基因groESL擴增雖不如16SrRNA應(yīng)用廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。Adrian等［17］通過巢式PCR鑒定和比對不同國家野生動物體內(nèi)AP的groEL不同，鑒定出新的菌株。因此，對于診斷及菌株的鑒定，groEL基因有重要意義。Massung等［18］在對ank基因鑒定并對AP進行種屬分型時也應(yīng)用該種方法。

2．2實時定量熒光PCR(realtimePCR)實時定量熒光PCR是將熒光共振能量傳遞現(xiàn)象、光學技術(shù)與常規(guī)PCR結(jié)合的一種PCR檢測技術(shù)。即在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)檢測熒光信號的強弱來實時測定特異性產(chǎn)物的量，從而實現(xiàn)核酸的精確定量，最后通過標準曲線對目的基因的初始量進行總量分析。由于實時熒光定量PCR儀自動化程度高，因此比常規(guī)PCR特異性更強且有效解決了常規(guī)PCR的污染問題。常用方法有SYBRgreen法和探針法(TaqManprobe)。Klaus-Peter等［10］將熒光染料摻入法(SYBRgreen)用于AP的抗生素藥物敏感性研究中。Joshua等［14］的研究中用探針法來鑒定AP和伯氏疏螺旋體。

2．3環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一種2000年開始出現(xiàn)的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術(shù)。其特點是針對靶基因的至少6個區(qū)域設(shè)計至少4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60～65℃恒溫擴增，15～60min即可實現(xiàn)109～1010倍的核酸擴增，具有靈敏度高、操作簡單、反應(yīng)時間短、特異性強、產(chǎn)物易檢測等特點。在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色。因此，可以把渾濁度作為反應(yīng)的指標，只用肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。由于LAMP反應(yīng)不需要PCR儀和昂貴的試劑，操作簡單方便。Lei等［15］用LAMP共針對目標基因8個區(qū)域設(shè)計6種特異性引物，特異性達100%。相比傳統(tǒng)PCR技術(shù)，LAMP的特點更適合HGA在農(nóng)村用于早期診斷，有著廣泛的應(yīng)用前景。

3小結(jié)與展望

分子生物學診斷AP的方法不僅快速、靈敏、操作簡便而且特異性強、重復(fù)性好。各種分子檢測方法各有優(yōu)缺點，簡要總結(jié)如下:巢式PCR用途廣泛，錯誤率低、特異性強但由于需要經(jīng)過兩次擴增且操作中需要開蓋處理，因此易污染;實時熒光定量PCR的自動化程度高，特異性強，可進行定量分析，但費用昂貴，對引物特異性要求高;LAMP不需要PCR儀和昂貴的試劑，操作簡單方便。更適用于農(nóng)村早期診斷。AP分子檢測技術(shù)不僅可用于HGA診斷，亦可對擴增產(chǎn)物進行測序并進行AP同源性比較，分析各地AP流行株、AP地域變異性和不同宿主AP多樣性。AP分子生物檢測技術(shù)也有局限性的一面，僅能判斷病原體的有無和拷貝數(shù)的多少，難以檢測病原體進入體內(nèi)后機體的反應(yīng)及其結(jié)果。

作者：王峰寶福凱柳愛華單位：昆明醫(yī)科大學病原生物學與免疫學系熱帶醫(yī)學研究所生物化學與分子生物學系