嗜吞噬細胞無形體的分子檢測范文

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《臨床檢驗雜志》2014年第六期

1診斷方法

1．1形態學診斷AP感染人和易感動物后，主要侵染成熟或未成熟的髓系白細胞。取可疑患者末梢血作厚、薄血涂片，經吉姆薩染色，于中性粒細胞胞漿內發現多個無形體緊密堆積在一起形成桑葚樣包涵體(morulaeelementarybody)可支持診斷。形態學診斷方法對采血時間要求嚴格，且診斷者要有較豐富的看片經驗，否則容易發生漏診和誤診。

1．2血清學診斷通過檢測患者血清中抗AP的IgM和IgG類抗體水平及升高程度，可特異性診斷HGA。常用方法為間接免疫熒光(immunofluorescenceassays，IFA)法。采集急性期(發熱初期，一般發病1周內)與恢復期(至少間隔2～3周)雙份血清。如恢復期血清抗體檢測陰性，應建議醫生采集第3份血液樣本(間隔2～4周)。如果同時檢測雙份血清，IgG抗體4倍升高，則結果強烈支持AP感染。如果急性期抗體升高，而恢復期沒有升高或輕微升高，則應采集第3份血液樣本(間隔2～4周)進行進一步檢測。血清學診斷方法準確，特異性高，但由于抗體出現較晚，診斷所需時間較長，故血清學檢測無法在早期對HGA進行診斷［3］。

1．3分離培養病原體多用人白血病細胞系HL60進行AP的分離培養。最常用的分離方法是將白細胞部分接種培養基，然后將100～500μL抗凝血接種到2×105或1×106個懸浮細胞內，每2～3d染色檢查包涵體，一般5～10d可查見包涵體。從患者血標本中分離AP是確診該病最可靠的方法，但細胞培養分離AP方法復雜和耗時，而且成功率不高。最終確認依然需要檢測AP特異性核酸。

1．4分子檢測方法AP感染可通過檢測AP的DNA進行診斷，AP的分子生物檢測方法可用于感染急性期的診斷，或用于后期病原體培養物的鑒定。分子檢測診斷方法具有較高敏感性、特異性和可重復性，而且診斷快速、操作簡單。

2AP分子檢測技術

AP分子檢測技術可用于對可疑患者血清樣本進行檢測，亦可對細胞培養后血細胞標本進行檢測，同時也用于AP傳播媒介－蜱的基因分子檢測和分類。AP的基因組由單股環狀染色體構成，長度為1471282bp，G+C百分比為41．6%，含有1369個開放讀碼框(ORF)。其特征性基因為外膜蛋白(majorsurfaceprotein，msp)以及ankA基因，100%的菌株具有msp2基因，70%的菌株具有ankA基因。目前AP分子檢測常用的目標包括編碼16SrRNA、熱激蛋白(heat-shockprotein，groESL)、msp蛋白、AnkA蛋白等的基因。16SrRNA高度保守，是PCR檢測最常擴增的靶基因，熱激蛋白基因groESL擴增雖不如16SrRNA應用廣泛，但groESL基因在不同種屬間具有較大的變異性，因此，對于診斷及菌株的鑒定有重要意義;msp編碼AP特征性外膜蛋白，這種蛋白質主要介導AP與不同宿主細胞間相互作用，并保證AP能更快地進入宿主細胞內。由于AP的宿主范圍很廣，包括多種脊椎動物和非脊椎動物，所以msp在不同來源的AP之間差異性大。其中msp2作為AP主要特征性外膜蛋白，已作為診斷AP感染的指征;ankA編碼的錨定蛋白能夠介導蛋白與蛋白之間的作用，因此AnkA在不同宿主間表現出多樣性［5］。目前ank基因鑒定通常用于msp2陽性病例基礎上，進行種屬分型［6］。AP感染的分子生物學診斷方法主要包括巢式PCR(nestedPCR)、實時定量熒光PCR(realtimePCR)和環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)等。PCR和PCR相關檢測技術是診斷AP感染的常規方法，目標基因與PCR引物見表1。

2．1巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是一種變異的PCR，使用兩對(而非一對)PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物(因其在第一次PCR擴增片段的內部)結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增產物。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產生了錯誤片段，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR檢測可提高檢測靈敏度和特異性，通常采用屬特異和種特異引物同時進行檢測。PCR檢測應分區進行，避免污染。16SrRNA高度保守，是巢式PCR檢測AP最常擴增的靶基因。由于AP的地域分布范圍廣，且有高度的生物學和臨床學多樣性，在比較不同地域發現的AP時最常用的方法就是巢式PCR。例如在波羅地海與挪威發現的AP比較研究就是用巢式PCR對16SrRNA和msp4進行測序分析［16］。Wuri-tu等用巢式PCR比較日本發現的AP與美國和歐洲AP的P44/msp2基因結構。熱激蛋白基因groESL擴增雖不如16SrRNA應用廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。Adrian等［17］通過巢式PCR鑒定和比對不同國家野生動物體內AP的groEL不同，鑒定出新的菌株。因此，對于診斷及菌株的鑒定，groEL基因有重要意義。Massung等［18］在對ank基因鑒定并對AP進行種屬分型時也應用該種方法。

2．2實時定量熒光PCR(realtimePCR)實時定量熒光PCR是將熒光共振能量傳遞現象、光學技術與常規PCR結合的一種PCR檢測技術。即在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，在PCR指數擴增期間通過連續檢測熒光信號的強弱來實時測定特異性產物的量，從而實現核酸的精確定量，最后通過標準曲線對目的基因的初始量進行總量分析。由于實時熒光定量PCR儀自動化程度高，因此比常規PCR特異性更強且有效解決了常規PCR的污染問題。常用方法有SYBRgreen法和探針法(TaqManprobe)。Klaus-Peter等［10］將熒光染料摻入法(SYBRgreen)用于AP的抗生素藥物敏感性研究中。Joshua等［14］的研究中用探針法來鑒定AP和伯氏疏螺旋體。

2．3環介導等溫擴增技術(LAMP)環介導等溫擴增技術(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一種2000年開始出現的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術。其特點是針對靶基因的至少6個區域設計至少4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60～65℃恒溫擴增，15～60min即可實現109～1010倍的核酸擴增，具有靈敏度高、操作簡單、反應時間短、特異性強、產物易檢測等特點。在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應溶液中的鎂離子反應，產生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現白色。因此，可以把渾濁度作為反應的指標，只用肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。由于LAMP反應不需要PCR儀和昂貴的試劑，操作簡單方便。Lei等［15］用LAMP共針對目標基因8個區域設計6種特異性引物，特異性達100%。相比傳統PCR技術，LAMP的特點更適合HGA在農村用于早期診斷，有著廣泛的應用前景。

3小結與展望

分子生物學診斷AP的方法不僅快速、靈敏、操作簡便而且特異性強、重復性好。各種分子檢測方法各有優缺點，簡要總結如下:巢式PCR用途廣泛，錯誤率低、特異性強但由于需要經過兩次擴增且操作中需要開蓋處理，因此易污染;實時熒光定量PCR的自動化程度高，特異性強，可進行定量分析，但費用昂貴，對引物特異性要求高;LAMP不需要PCR儀和昂貴的試劑，操作簡單方便。更適用于農村早期診斷。AP分子檢測技術不僅可用于HGA診斷，亦可對擴增產物進行測序并進行AP同源性比較，分析各地AP流行株、AP地域變異性和不同宿主AP多樣性。AP分子生物檢測技術也有局限性的一面，僅能判斷病原體的有無和拷貝數的多少，難以檢測病原體進入體內后機體的反應及其結果。

作者：王峰寶福凱柳愛華單位：昆明醫科大學病原生物學與免疫學系熱帶醫學研究所生物化學與分子生物學系