不同有機(jī)氮源對(duì)葡萄酒發(fā)酵的作用范文

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《葡萄酒》2018年第4期

摘要：分別使用酵母浸粉和混合氨基酸作為模擬葡萄汁（36°Bx）的有機(jī)氮源發(fā)酵葡萄酒，以保證葡萄酒的正常發(fā)酵和最終產(chǎn)品品質(zhì)。通過測定發(fā)酵過程中的二氧化碳生成量、還原糖、可同化氮、甘油和揮發(fā)性化合物含量變化，比較酵母浸粉和混合氨基酸對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，使用酵母浸粉耗還原糖量為295.7g/L，生成乙醇97.20g/L、甘油26.50g/L、乙酸1.08g/L和乙酸乙酯46.05mg/L，與使用混合氨基酸相比，多消耗還原糖130.47g/L，多生成乙醇46.14g/L、甘油7.95g/L和乙酸0.54g/L，增幅分別為78.95%、90.38%、42.84%和99.35%。使用酵母浸粉比混合氨基酸的發(fā)酵程度大，速度快。因此，可用適量酵母浸粉替代混合氨基酸作為葡萄酒發(fā)酵的氮源補(bǔ)充。

關(guān)鍵詞：葡萄酒；氮源；發(fā)酵；酵母浸粉；氨基酸

隨著葡萄酒消費(fèi)量的增加，對(duì)葡萄酒品質(zhì)的要求也越來越高。葡萄酒品質(zhì)與釀酒葡萄原料和釀造工藝密切相關(guān)[1]。酵母可同化氮（yeastassimilablenitrogen，YAN）即能被酵母利用的氮源，主要是除脯氨酸外的α-氨基酸、小分子多肽和銨態(tài)氮這三類氮源[2]。葡萄原料的可同化氮含量直接影響酵母菌的生長和代謝，從而影響葡萄酒的發(fā)酵過程和最終產(chǎn)品質(zhì)量。當(dāng)釀酒葡萄中可同化氮含量過低時(shí)，會(huì)影響發(fā)酵速度并產(chǎn)生有刺激性的二氧化硫氣體影響酒的品質(zhì)[3]。為保證氮源不足的葡萄原料正常發(fā)酵，常添加無機(jī)氮源如磷酸氫二銨，或添加氨基酸。添加銨鹽或單一氨基酸會(huì)導(dǎo)致酵母利用更多的糖合成氨基酸，使乙醇轉(zhuǎn)化率下降，同時(shí)影響葡萄酒中有機(jī)酸生成[4]。使用混合氨基酸作為補(bǔ)加氮源能保證葡萄酒發(fā)酵的進(jìn)程和品質(zhì)[5]。酵母浸粉含有大量的氨基酸、肽、小分子蛋白、核苷酸、糖、維生素和風(fēng)味化合物，常用作抗生素、氨基酸、有機(jī)酸、酶制劑等發(fā)酵生產(chǎn)的氮源[6]，也有用作酸奶發(fā)酵氮源的探討[7]。在葡萄酒氮源補(bǔ)充方面，目前主要選用無機(jī)氮源和氨基酸，對(duì)混合氨基酸作氮源的研究僅測定了糖、甘油、乙醇、乙酸等呈味物質(zhì)，并未測定高級(jí)醇產(chǎn)量[8-10]。而且，尚無酵母浸粉的應(yīng)用先例。為了探究酵母浸粉是否適合作為葡萄酒發(fā)酵的補(bǔ)加氮源，本研究分別以相同可同化氮含量的酵母浸粉和混合氨基酸作為模擬葡萄汁唯一氮源，進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵，從發(fā)酵過程中的二氧化碳生成量以及還原糖、可同化氮、甘油和揮發(fā)性化合物含量，對(duì)比兩種氮源對(duì)葡萄酒發(fā)酵過程和葡萄酒品質(zhì)的影響，以探究酵母浸粉作為葡萄酒發(fā)酵氮源不足時(shí)補(bǔ)加氮源的可能性。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

商業(yè)酵母ST：法國LAFFORT公司；717型陰離子交換樹脂：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2化學(xué)試劑

葡萄糖、果糖：山東西王藥業(yè)有限公司；酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物試劑有限公司；各種氨基酸、乙醛：上海阿拉丁生化科技有限公司。乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸：天津市恒興化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；異戊醇：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

GC6850氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；722S可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TELTA320pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；CR21GⅢ離心機(jī)：日立工機(jī)株式會(huì)社。

1.3方法

1.3.1酵母馴化

為了適應(yīng)葡萄酒發(fā)酵的高糖低溫環(huán)境，需對(duì)活性干酵母進(jìn)行逐級(jí)馴化，再將種子液接種到發(fā)酵液中。本實(shí)驗(yàn)涉及的活性干酵母馴化步驟如下：稱取1g活性干酵母加入10mL無菌水中進(jìn)行溶解，在38℃條件下恒溫培養(yǎng)15min，每5min輕微攪動(dòng)一次。隨后加入10mL稀釋2倍的模擬葡萄汁，在25℃條件下恒溫培養(yǎng)1h，每30min攪動(dòng)一次。最后加入20mL模擬葡萄汁，20℃條件下恒溫培養(yǎng)2h，每30min攪動(dòng)一次。得到酵母種子液。

1.3.2模擬汁成分

葡萄糖180g/L、果糖180g/L、檸檬酸0.5g/L、蘋果酸5g/L、酒石酸5g/L、磷酸二氫鉀5g/L、無水硫酸鎂0.5g/L。氮源：兩組分別添加酵母浸粉和混合氨基酸作為唯一氮源，氮源添加量為180mg/L酵母可同化氮（YAN）。此含量為普通葡萄汁中平均有機(jī)氮源含量。即分別添加酵母浸粉3.9g/L，混合氨基酸（180mg/L）[11]。

1.3.3葡萄酒發(fā)酵

每瓶接入馴化后的種子液12mL，于18℃條件下控溫發(fā)酵。發(fā)酵體系為1L玻璃瓶：瓶高35cm，直徑7.6cm，瓶口外徑2.5cm，瓶徑長6cm。在1L酒瓶中裝500mL模擬汁，每瓶接入馴化后的種子液12mL，于18℃條件下控溫發(fā)酵。發(fā)酵前2d用棉塞封瓶口，當(dāng)發(fā)酵液中有氣體產(chǎn)生時(shí)，把棉塞換為發(fā)酵栓，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。

1.3.4取樣及樣品

預(yù)處理發(fā)酵過程中前期（0～10d）每3天取樣一次，中期（10～20d）和后期（20～30d）每5d取樣一次，取樣量為35mL。發(fā)酵液于4℃，10000r/min離心10min得發(fā)酵上清液，將其保存于-20℃冰箱中，待測定。測定各理化指標(biāo)時(shí)，于4℃冰箱中解凍。

1.3.5分析檢測

二氧化碳生成量測定：采用發(fā)酵體系失重測量法。充分晃動(dòng)裝有發(fā)酵栓的玻璃瓶，使發(fā)酵液充分混勻且其中溶解的二氧化碳完全溢出，然后采用電子天平進(jìn)行測量[12]。還原糖含量測定：將發(fā)酵上清液用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylicacid，DNS）法測定還原糖含量[13]。甘油含量測定：采用高碘酸氧化法[14]。步驟：①處理樹脂。用1mol/LNaOH和HCl按照堿-酸-堿的順序?qū)?01×7型強(qiáng)堿陰離子交換樹脂進(jìn)行洗脫。洗脫時(shí)用樹脂體積的3～5倍的1mol/LNaOH或HCl洗脫1h，最后用去離子水洗至中性并用17g/L的AgNO3檢測是否有氯離子存在，如有則繼續(xù)用去離子水洗至無氯離子后備用。②裝柱。取洗脫后的樹脂，填裝到長20mL，內(nèi)徑1cm的玻璃柱中，調(diào)整液面高于樹脂表面0.5cm左右。③上樣。取2mL發(fā)酵上清液加入到玻璃柱中。④收集洗脫液。上樣后開始收集洗脫液，控制流速為2mL/min左右。洗脫時(shí)，加入無二氧化碳去離子水保持液面距樹脂表面0.5cm左右，每管收集洗脫液2mL。⑤洗脫液檢測。每管洗脫液中取0.2mL進(jìn)行還原糖檢測，直至洗脫液中出現(xiàn)還原糖為止。可同化氮含量測定：采用甲醛值法[15]。量取50mL甲醛溶液于100mL燒杯中，置于磁力攪拌器上，將pH電極放到燒杯中合適的位置，邊攪拌邊用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)整甲醛溶液pH8.5，備用。在5mL發(fā)酵上清液中加45mL去離子水和3滴30%過氧化氫。在磁力攪拌下，用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)整上述混合液的pH值為8.5。然后加入2mLpH8.5的甲醛溶液，反應(yīng)3min，用0.01mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至pH8.5。記錄消耗0.01mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積。揮發(fā)性化合物的測定采用氣相色譜法。樣品前處理：準(zhǔn)確移取7mL發(fā)酵上清液于頂空氣相瓶中，加入1.4gNaCl固體和磁力攪拌轉(zhuǎn)子，壓蓋器密封頂空瓶蓋，放在磁力攪拌器（350r/min、45min）上使NaCl充分溶解，放置于進(jìn)樣槽。靜態(tài)頂空氣相色譜（headspacegaschromatography，HS-GC）條件：安捷倫7697A頂空進(jìn)樣器，AgilentDB-FFAP色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm），檢測器是氫火焰檢測器（flameionizationdetector，F(xiàn)ID），空氣流量300mL/min，氫氣流量30mL/min，載氣（氮?dú)猓┝髁?0mL/min。分流進(jìn)樣：分流比是10∶1；進(jìn)樣量2μL；樣品平衡溫度90℃；樣品平衡時(shí)間30min；進(jìn)樣口溫度250℃，檢測器溫度250℃。升溫程序：初始溫度40℃，保持10min，然后以5℃/min升至190℃，保持1min，接著以20℃/min升至230℃，保持2min。定性定量方法：選擇含量較高和影響較大的7種揮發(fā)性化合物（乙醇、乙酸、乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇）標(biāo)準(zhǔn)品，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，以各種揮發(fā)性化合物的色譜出峰時(shí)間作為樣品組分的定性依據(jù)。將處理好的樣品按上述色譜條件進(jìn)行分析，以各揮發(fā)性化合物的色譜峰面積進(jìn)行定量。

1.3.6數(shù)據(jù)分析

本研究的不同氮源發(fā)酵均采取兩組平行，所有理化指標(biāo)均為3個(gè)平行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為平行實(shí)驗(yàn)的平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS24進(jìn)行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同氮源的葡萄酒發(fā)酵二氧化碳生成量在葡萄酒發(fā)酵過程中，伴隨著二氧化碳的生成和排放，發(fā)酵體系的質(zhì)量減少。因此，發(fā)酵系統(tǒng)減少的質(zhì)量即二氧化碳生成量。通常用二氧化碳生成量衡量發(fā)酵狀態(tài)。

2.2不同氮源的葡萄酒發(fā)酵還原糖含量還原糖作為葡萄酒發(fā)酵的能源和碳源，在發(fā)酵過程中逐漸被消耗，常用其含量變化衡量發(fā)酵進(jìn)度。還原糖剩余量也影響最終葡萄酒的品質(zhì)。

2.3不同氮源的葡萄酒發(fā)酵甘油含量甘油無揮發(fā)性、無氣味，不影響葡萄酒香氣；具有甜味、黏性，有利于提高葡萄酒的質(zhì)量。提高甘油含量會(huì)增加葡萄酒的甜味和黏度[16]。

2.4不同氮源的葡萄酒發(fā)酵可同化氮含量可同化氮含量會(huì)影響發(fā)酵過程中酵母的生長和代謝，影響乙醇、甘油、酯類、乙酸、高級(jí)醇、乙醛和H2S等含量[4]。

2.5不同氮源的葡萄酒發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)含量

2.5.1乙醇含量YAN為180mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵乙醇含量變化。

2.5.2乙酸含量乙酸是酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，由酵母的異常代謝生成。由于其具有特殊氣味和口味，因此在葡萄酒中應(yīng)控制乙酸含量，一般不宜超過1.2g/L[20]。YAN為180mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵乙酸含量變化。

2.5.3乙醛含量乙醛是酒精發(fā)酵過程中通過丙酮酸脫羧形成，隨后被還原成乙醇。含量過高（≥80mg/L）會(huì)影響葡萄酒的品質(zhì)[12]。YAN為180mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵乙醛含量變化。

2.5.4乙酸乙酯含量乙酸乙酯具有甜味和果香味，濃度過高時(shí)有刺激性氣味，因此葡萄酒中乙酸乙酯含量不宜過高[16]。YAN為180mg/L的不同氮源的葡萄酒發(fā)酵乙酸乙酯含量變化結(jié)果見圖8。由圖8可知，酵母浸粉組和混合氨基酸組乙酸乙酯含量變化趨勢基本相同。在發(fā)酵各個(gè)時(shí)期酵母浸粉組乙酸乙酯含量始終高于混合氨基酸組，最終兩組乙酸乙酯含量分別為46.05mg/L和32.35mg/L，差異顯著（P＜0.05）。由于發(fā)酵過程中的乙酸乙酯是由乙酸和乙醇合成[21]，因此乙酸乙酯含量與乙酸含量變化趨勢相似。

2.5.5高級(jí)醇含量高級(jí)醇是酵母菌異常代謝的產(chǎn)物，普遍具有刺激性，含量在250～350mg/L為宜，含量過高（≥550mg/L）時(shí)易使飲用者有“上頭”感[22]。3結(jié)論本研究分別采用酵母浸粉和混合氨基酸為模擬葡萄汁發(fā)酵的可同化氮源，在可同化氮供應(yīng)量均為180mg/L的情況下，兩組的可同化氮消耗量也基本相同，分別為89.41mg/L和84.17mg/L。兩組各生成物含量都在國標(biāo)允許范圍內(nèi)[15，24]，與混合氨基酸相比，使用酵母浸粉還原糖消耗量增加130.47g/L，增加乙醇46.14g/L、甘油7.95g/L、乙酸0.54g/L，增幅分別為78.95%、90.38%、42.84%和99.35%。兩組乙酸乙酯和高級(jí)醇生成量無明顯差異（P＞0.05）。可見，酵母浸粉作氮源不同程度地促進(jìn)了模擬葡萄汁發(fā)酵中還原糖的消耗和各種物質(zhì)的生成。由此可以證明，酵母浸粉可以作為葡萄酒發(fā)酵的氮源補(bǔ)充，添加少量酵母浸粉有利于加快發(fā)酵速度，但若大量添加酵母浸粉可能會(huì)導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)的降低。

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作者：謝詩怡；韓月；張燁；孫玉梅 單位：大連工業(yè)大學(xué)