固體支撐脂質雙層膜與蛋白的相互作用范文

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《光散射學報》2017年第2期

摘要：

固體支撐脂質雙層膜能很好的模擬生物膜系統，固體襯底的表面結構和性質會影響雙層膜的成膜過程、流動性、微區形成以及化學活性，進而影響蛋白的特性。本文，我們在兩種襯底云母和二氧化硅表面，構建了包含神經節苷脂GM1的固體支撐脂質雙層膜，用拉曼光譜研究了兩種襯底表面脂質膜的分子構象。并且，在脂質膜表面加入淀粉樣－beta蛋白，分析兩種襯底上淀粉樣－beta蛋白的構象差異。

關鍵詞：

固體支撐脂質雙層膜；Aβ蛋白；拉曼光譜；云母；二氧化硅

1引言

神經節甘脂GM1（GM1）對于許多神經系統中的細胞功能都有重要價值，如信號轉導、神經元分化和軸突、樹突和突觸的形成。GM1由酰基鏈和一個復雜的頭基端組成［1－2］。研究表明，GM1會與淀粉樣－beta（Aβ）蛋白形成種子，可以促進Aβ蛋白的構象轉變，從無規卷曲到α－helix和β－sheet結構，導致Aβ蛋白形成寡聚體和纖維化，并且具有毒性。這種具有毒性的Aβ蛋白在阿爾茨海默癥（AD）中會引起神經元細胞的死亡［3－11］。固體支撐脂質雙層膜（SPBs）是很好的模擬生物膜系統，但固體襯底的表面結構和性質會影響雙層膜的成膜過程、流動性、微區形成以及化學活性。不同襯底上的脂質膜對Aβ蛋白構象的影響有很大差異，特別是含有GM1的脂質體雙分子層。有報道研究了云母和二氧化硅（SiO2）表面包含GM1的脂質膜與Aβ蛋白的相互作用。該研究通過原子力顯微鏡（AFM）觀察，在云母和SiO2表面SPBs的構象有所差異，并且，在同等條件下云母表面Aβ蛋白聚集和纖維化的速度要大于SiO2表面的［12］。拉曼光譜可以提供有效的分子結構信息。因為液體環境下水的拉曼散射比較弱，所以用拉曼光譜研究液體環境下的分子結構更方便。但是拉曼散射效應是很弱的，很容易被溶劑的熒光淹沒。最近，拉曼光譜在解決生物問題方面得到廣泛關注，已經被成功運用于檢測細胞成分和代謝活動。但是，因為脂質雙層膜的厚度只有4～6nm，所以拉曼光譜很難被探測到。因此，一種復雜的結合拉曼光譜儀，顯微鏡和共聚焦系統的拉曼光譜系統被研發，該系統可以提高分辨率和信號采集效率，從而，可用于研究脂質膜的拉曼光譜［13］。本文主要運用拉曼光譜對比分析了兩種襯底云母和SiO2表面的GM1／SM／CholSPBs的分子構象，以及加入Aβ蛋白后構象變化的差異，從分子水平分析了襯底材料對脂質雙層膜構象的影響，以及對Aβ蛋白聚集速率的影響。

2實驗方法

2．1材料和試劑單唾液酸四己糖神經節苷脂（GM1），膽固醇（Chol）和Amyloidbeta1－40（Aβ（1－40）購買自Sigma－Aldrich公司，鞘磷脂（SM）和C6－NBD－鞘磷脂（NBD－SM）購買自Avanti公司，其它試劑均為國產分析純。

2．2親水性基底的處理親水性基底SiO2是通過對Si（100）做濕氧化處理得到的，將Si（100）經過一系列處理：H2SO4＋H2O2（30％）（容量比4∶1），HF（5％），進而HCl＋H2O2（30％）＋H2O（1∶1∶4）。

2．3SPBs，單體Aβ（1－40）溶液的制備GM1、SM和Chol的摩爾比例為5／55／40和20／40／40。首先，取適量的GM1，SM和Chol分別溶于氯仿／甲醇（1∶1，v／v）混合溶液中，利用氮氣使溶液蒸發，并在真空干燥箱中放置整夜，以形成干燥的膜，將干燥的混合磷脂溶于超純水中，達到最終濃度0．12mg／mL。將該混合溶液進行冷凍－融化三次，后在60℃下超聲，最終得到磷脂囊泡溶液（SUVs）。制備用于觀察熒光的SUVs時，需要用NBD－SM對SUVs進行熒光標記，NBD－SM的濃度為1％（mol／mol）。制備好SUVs后，取200!LSUVs溶液滴到直徑10mm的新鮮固體襯底表面，在室溫下放置30分鐘，70℃放置15分鐘后冷卻到室溫。最后，用超純水清洗四遍移除未破裂的囊泡，所有的樣品都是在聚四氟乙烯的樣品池里制備。將Aβ（1－40）蛋白溶于0．02％的氨水溶液中，將溶液在14，000rpm，4℃下離心3h（BeckmanInstruments），得到單體的Aβ（1－40）蛋白，濃度為600!M，在－20℃下分裝儲存。使用時，將Aβ（1－40）溶液用緩沖液稀釋至100!M。

2．4熒光顯微鏡和拉曼光譜儀SPBs表面形貌的熒光圖像是在熒光顯微鏡（O－lympus）上觀察，經CCD（NikonDS－2MBW）處理得到的。拉曼光譜是在WITECRSA300＋上測得，激發光源是632．8nm，光譜范圍是0～4000cm－1，累計時間是5s，物鏡放大倍數為100，光源功率低于0．5mW，從而避免激光對樣品造成破壞。

3結果和討論

3．120GM1／40SM／40Chol－SPBs在云母和SiO2上的表面形貌

我們用比例為20GM1／40SM／40Chol的SU－Vs溶液通過囊泡融合法在云母和SiO2表面形成平坦的SPBs。為了確認形成了磷脂膜雙層的膜，我們用熒光顯微鏡對其形貌進行觀察。圖1是云母和SiO2表面形成的SPBs的一系列熒光漂白恢復圖像（FRAP），a為云母表面的FRAP圖像，b為SiO2表面的FRAP圖像，進行漂白后熒光還能恢復是因為NBD－SM的橫向擴散。可以看到在SiO2表面和云母表面都形成了非常平坦完整的SPBs，未破裂的囊泡量很少。如圖1所示，兩種基底上的SPBs都能實現熒光恢復。表明在兩種襯底表面，SPBs都處于液相狀態。這是因為液相狀態的擴散系數比凝膠狀態大幾個數量級，液相的SPBs熒光恢復時間比凝膠狀態快得多［14－15］。但是在5min時和10min時云母表面比SiO2表面熒光恢復較快，表明云母表面SPBs的流動性更好。

3．2GM1／SM／Chol－SPBs在云母和SiO2上的拉曼光譜

在云母和SiO2表面形成SPBs（20GM1／40SM／40Chol）后，直接對其進行拉曼測試。圖2是云母和SiO2表面的SPBs的拉曼光譜，光譜a為云母表面的SPBs，b為SiO2表面。表1給出了拉曼光譜的峰值頻率和歸屬。C－C振動（1000～1200cm－1），如圖2A所示，光譜a和b的C－C伸縮振動區域1000～1150cm－1都相應出現了幾個峰，這個區域有利于觀察磷脂雙層膜中酰基鏈的變化。對于酰基鏈的拉曼振動，已經通過對磷脂膜的簡正坐標分析和推論進行過研究［16－18］。C－C振動對亞甲基鏈的的偏轉和全反式構象很敏感，并且受亞甲基旋轉和變形影響很小。如果酰基鏈是全反式鏈，拉曼光譜將會出現1060cm－1（反對稱C－C伸縮）和1125cm－1（對稱C－C伸縮）兩個峰［18－19］。而1085cm－1譜帶歸屬于有偏轉缺陷的全反式［19］，光譜a，b中這個峰的出現表明在云母和SiO2基底表面形成的SPBs具有偏轉構象，而不是“全反式”。在光譜圖2A光譜a中，1019cm－1來自于GM1中N－乙酰神經氨酸（Neu5Ac）的C－C振動。GM1是含有唾液酸的糖脂，而Neu5Ac是唾液酸的主要形式，在GM1的頭端有Neu5Ac結構［20］。而在光譜b中，因為SiO2在～970cm－1處有很強的特征峰，從而將Neu5Ac的特征峰1019cm－1遮蓋，無法觀測到Neu5Ac的特征振動。我們在圖3中列出了云母和SiO2的拉曼光譜，其中圖3A對應于云母的拉曼峰，圖3B對應于SiO2。對于圖2A光譜a的特征峰1110cm－1，它既來自于磷脂分子C－C振動，也有來自云母基底的貢獻。因為云母在500～1110cm－1有豐富的振動峰（圖3A），在這個區域，我們也無法分析SPBs的構象信息。另外，Si基底在～520cm－1和～970cm－1都有很強烈的特征峰（圖3B），將SPBs在該部分的分子振動特征掩蓋。因此，在SiO2表面的SPBs拉曼譜1060cm－1之前的區域，我們也無法分析SPBs的構象。CH2扭轉／搖擺／彎曲（1200～1600cm－1）。這個區域來自于CH2的扭動／搖擺／彎曲模式。在圖2中，1295cm－1來自于CH2的扭轉，1374cm－1來自于CH2的搖擺［21－22］。另外，CH2彎曲的拉曼特征在光譜a和b中分別出現在1433cm－1和1454cm－1，這兩個峰只在六方晶相結構中出現［23］，表明磷脂分子是晶體結構。并且，這個區域受分子內和分子間費米共振相互作用。對全反式酰基鏈的相關研究表明，搖擺的基本面（723～735cm－1）和未受擾動的彎曲的基本面（1442cm－1）之間的費米共振，會在1433cm－1處產生一個很強的，在1454cm－1有一個弱的拉曼峰。然而，如果酰基鏈是單斜或斜方晶系，在1418cm－1處還會出現拉曼峰［23－24］。因此，從SPBs的拉曼特征振動可知在云母和SiO2表面形成的SPBs（20GM1／40SM／40Chol）都處于六方晶相。CH2和CH3伸縮區域（2800～3000cm－1）。CH2和CH3伸縮振動的拉曼特征都出現在2800～3000cm－1。如圖3所示，譜帶2904cm－1（光譜a）和2902cm－1（光譜b）來自于νsFR（CH2）振動，2929cm－1（光譜a）和2926cm－1（光譜b）與νs（CH3）相關［14，25］，這兩個譜帶在光譜a和b中幾乎相同。另外，光譜a中，亞甲基的對稱和不對稱伸縮出現在2843和2878cm－1，光譜b中出現在2846和2878cm－1。從拉曼譜帶強度得出的參數可以用于估計脂質雙層的分子間相互作用，2843cm－1和2880cm－1的峰強比，表示為I2878／I2843，反應了鏈間橫向相互作用［14，25］。光譜b中I2878／I2846比值比光譜a中I2878／I2843略大，這表明SiO2表面的SPBs橫向鏈間相互作用比云母表面的略大，SPBs流動性較小，這與FRAP結果相一致。

3．3云母和SiO2上SPBs加入Aβ（1－40）后的拉曼光譜

為了研究不同基底材料對Aβ（1－40）和SPBs相互作用的影響，我們在云母和SiO2上形成GM1／SM／CholSPBs后，直接在其表面加入100!M的單體Aβ（1－40）溶液，Aβ（1－40）的最終濃度為1!M，將樣品池37℃下恒溫放置12h，之后進行拉曼測試。如圖4所示，光譜a代表云母表面的拉曼光譜，光譜b代表SiO2表面的拉曼光譜，圖4A是1000～1800cm－1區域的拉曼光譜，圖4B對應于2800～3000cm－1區域。如圖4A光譜a所示，相比于云母上的SPBs的拉曼譜（圖2A光譜a），加入Aβ（1－40）后，SPBs的拉曼光譜1019cm－1幾乎消失，我們將這個變化歸因氨基酸和GM1頭端的Neu5Ac可能發生了直接相互作用。另外光譜a和b都出現了新的峰1260cm－1，它對應于Aβ（1－40）蛋白amideIII的α－螺旋結構。這個峰的出現表明，此時在兩種基底上Aβ（1－40）都發生了無規卷曲結構到α－螺旋結構的轉變。另外，光譜a中，1374cm－1發生輕微偏移至1381cm－1，它既代表磷脂分子CH2擺動，又與多肽的amideS結構有關（amideS的出現與β－折疊結構相關）［26］。在1410cm－1出現新的譜帶，可以歸屬于Aβ（1－40）的酪氨酸殘基［27］。這兩個峰的變化在光譜b中都沒有表現。光譜a和b的差別表明，在兩種基底上，Aβ（1－40）都表現出了α－螺旋結構，云母表面Aβ（1－40）已經聚集并出現了β－折疊結構和氨基酸殘基的信號峰，而在SiO2表面卻還沒有表現出來。從圖4B中2800～3000cm－1光譜區域分析發現，在云母表面的拉曼光譜發生了很大變化，而在SiO2表面這個區域的拉曼峰與圖2中幾乎一樣。與圖2B中云母表面（光譜a）相比，2846，2878cm－1偏移至2845和2881cm－1，比值I2881／I2843變大。這說明，加入Aβ（1－40）12h后，SPBs的鏈間橫向相互作用變大，SPBs趨向于凝膠狀態。另外，來自于νsFR（CH2）的2904cm－1偏移至2901cm－1并且峰強明顯變大。2929cm－1（νs（CH3））減弱幾乎消失，2962cm－1（νa（CH3））增強很多，這兩個峰屬于SPBs疏水部分的甲基頭端。這些變化表明在云母表面Aβ（1－40）與SPBs疏水端的相互作用，疏水鏈包含酰基鏈和甲基頭端。而在SiO2表面Aβ（1－40）與SPBs相互作用速度較慢，此時Aβ（1－40）沒有進入到疏水部分。隨著Aβ（1－40）加入時間增加，拉曼光譜繼續發生變化，圖5表示的是在SPBs表面加入Aβ（1－40）24h后的拉曼光譜。光譜a為云母表面的拉曼光譜，光譜b代表SiO2表面的拉曼光譜。圖5A是1000～1800cm－1區域的拉曼光譜，圖5B是2800～3000cm－1區域的拉曼光譜。在云母表面，與12h的拉曼光譜相比，24h的光譜a又有幾個新的峰出現，1003，1188，1211和1240cm－1。其中，1003cm－1處窄的強的譜帶來自于Aβ（1－40）的苯丙氨酸，1188cm－1和1211cm－1可以歸屬于Aβ（1－40）的酪氨酸［27］。這幾個來自氨基酸殘基的拉曼特征峰在光譜b中都沒有出現。我們可以將這兩種氨基酸強度的增加歸因于隨著蛋白加入時間增加，說明Aβ（1－40）在云母表面比在SiO2表面聚集更多。光譜a中，amideIII（1230～1300cm－1）的拉曼信號出現在1240cm－1，光譜b中在1244cm－1，對應于amideIII的β－折疊結構［28］。與此同時，光譜a中代表amideIII的α－螺旋結構出現在1260cm－1，光譜b中出現在1268cm－1處［28］。光譜a中表示CH2扭轉的1300cm－1比圖4中a強度更強，這可能是因為Aβ（1－40）對SPBs酰基鏈的亞甲基產生了影響。Aβ（1－40）的amideI（1590～1725cm－1）在1656cm－1的強度明顯增強，那是因為Aβ（1－40）蛋白發生了更多的聚集和構象轉變。在光譜b中，1202cm－1，1656cm－1強度增加幅度較小。說明SiO2表面Aβ（1－40）聚集程度比云母上小。對于2800～3000cm－1區域（圖5B），與圖4B中a相比，CH振動強度整體增強幅度較大，2845，2881cm－1偏移至2849和2874cm－1，并且I2874／I2849比圖4中I2881／I2843大。且2902和2962cm－1明顯增強。這說明隨著Aβ（1－40）加入更長時間，云母表面聚集更多Aβ（1－40），并且蛋白與SPBs疏水端作用更強烈，SPBs趨向于凝膠狀態，膜在一定程度被破壞。而光譜b中無論是峰強及峰位變化都較小。表明在SiO2表面Aβ（1－40）聚集以及與SPBs疏水端的相互作用程度比較弱。從上述結果可以看到，由于襯底的作用，導致SiO2表面上形成的脂質雙層膜的流動性較小，橫向鏈間相互作用較大。另外GM1是含有唾液酸的糖脂，Neu5Ac是唾液酸的主要形式，它的特征峰1019cm－1只出現在云母襯底上，并且在加入Aβ后這個特征峰的消失表明Neu5Ac與Aβ蛋白的直接相互作用。這些證明了在云母上GM1的Neu5Ac功能團很可能是暴露在上面的，而且由于較好的流動性很可能使得GM1聚集形成了團簇。暴露在表面的聚集的Neu5Ac通過發生CH－π相互作用綁定Aβ，但是在SiO2襯底上團簇的形成較為困難，Neu5Ac也可能不是暴露在膜表面的，所以對Aβ的綁定相對較少。這從酪氨酸和苯丙氨酸的特征振動沒有出現，而且α－螺旋結構和β－折疊結構的特征振動峰相對較弱也可以證明，說明Aβ（1－40）在SiO2表面比在云母表面聚集的少，使Aβ構象轉變相對較慢。另外在SiO2表面脂質雙層膜疏水端的變化也比較緩慢，而云母表面隨著Aβ（1－40）加入更長時間，蛋白與SPBs疏水端作用強烈，SPBs趨向于凝膠狀態，膜在一定程度上被破壞。Aβ（1－40）與SPBs相互作用是通過疏水性C終端插入雙層膜中與脂質體的疏水性酰基鏈相互作用，很可能因為SiO2表面有較大的橫向相互作用，C終端的插入相對比較困難，所以SiO2襯底上GM1／SM／CholSPBs的疏水端在Aβ蛋白的作用下基本上沒有變化。

4結論

GM1，SM和Chol是等離子膜脂筏的主要成分，這些脂筏被對信息傳導，細胞運輸脂質排序起到重要作用，經常作為細胞膜模擬體系用于研究。固體支撐脂質雙層膜是很好的模擬生物膜系統，但固體襯底的表面結構和性質會影響脂質膜的成膜過程、流動性、微區形成以及化學活性。在本論文中，利用囊泡融合法在云母和SiO2表面都形成了平坦均勻的GM1／SM／CholSPBs，通過拉曼光譜分析云母表面的SPBs流動性比SiO2表面要好，從分子水平上分析了基底材料對磷脂分子構象的影響。加入Aβ蛋白后，不同時間的拉曼光譜表明基底材料對蛋白構象變化有所影響。Aβ蛋白在SiO2表面比在云母表面聚集的少，使Aβ蛋白構象轉變相對較慢。在SiO2表面，Aβ蛋白與脂質雙層膜疏水端作用比較緩慢。而在云母表面，隨著Aβ加入的增加，蛋白與SPBs疏水端相互作用比SiO2強烈。

作者：胡智萍 王肖麗 張振龍 程秀英 毛艷麗 單位：河南大學物理與電子學院 河南大學計算材料科學研究所