猴頭菌絲固體培養(yǎng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)探究范文

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《廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)》2016年第5期

摘要：

目的建立猴頭菌絲固體培養(yǎng)物的質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)，為有效控制該藥材的質(zhì)量提供參考。方法采用薄層色譜法對(duì)猴頭菌絲固體培養(yǎng)物中的甘氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸進(jìn)行定性鑒別；參照2015年版《中國(guó)藥典》中相關(guān)方法，分別對(duì)猴頭菌絲固體培養(yǎng)物中的水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分進(jìn)行測(cè)定；分別采用紫外⁃可見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定猴頭菌絲固體培養(yǎng)物中多糖和腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果薄層色譜定性鑒別斑點(diǎn)清晰，特征明顯；猴頭菌絲固體培養(yǎng)物中水分不得超過(guò)11.0％、水溶性浸出率不得低于12.3％、醇溶性浸出率不得低于4.5％、總灰分不得超過(guò)6.5％、酸不溶性灰分不得超過(guò)1.5％，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于2.23％，腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.0123％。結(jié)論所建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，能全面、有效地控制該猴頭菌絲固體培養(yǎng)物的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：

猴頭菌絲；固體培養(yǎng)物；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；腺苷；多糖；氨基酸

猴頭菌隸屬于擔(dān)子菌門(mén)、猴頭菌科，因其子實(shí)體形如猴頭、色如猴毛，故取名“猴頭”。猴頭菌是著名的藥食兼用菌，性平味甘，具有助消化、利五臟的功能，營(yíng)養(yǎng)豐富，素有“山珍猴頭，海味燕窩”之說(shuō)［1］。目前，我國(guó)已有100多個(gè)以猴頭菌為主要原料的用于胃腸道疾病治療的準(zhǔn)字號(hào)藥［2］。猴頭菌含有多糖、寡糖、蛋白質(zhì)、核苷、甾醇、吡喃酮等多種活性成分。現(xiàn)代藥理研究表明，猴頭菌具有提高免疫力［3］、抗感染［4］、抗腫瘤［5］、抗氧化［6］、降血糖［7］等多種生理功能，長(zhǎng)期服用安全有效，極少發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)和毒副作用。本文所用的猴頭菌絲固體培養(yǎng)物為菌絲發(fā)酵后培養(yǎng)基與菌絲的復(fù)合體，呈棕色或棕黃色的條狀、塊狀、纖維狀。近年來(lái)，有關(guān)猴頭菌化學(xué)成分、藥理作用的研究報(bào)道很多［8⁃9］，但關(guān)于其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究卻很少，現(xiàn)行部版標(biāo)準(zhǔn)（WS3—B—3457—98）項(xiàng)下僅有鑒別、檢查與多糖含量測(cè)定項(xiàng)。為進(jìn)一步提高猴頭菌絲固體培養(yǎng)物質(zhì)量控制水平，規(guī)范其質(zhì)量，本文在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對(duì)10批猴頭菌絲固體培養(yǎng)物中的甘氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸進(jìn)行定性鑒別，對(duì)水分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、多糖、腺苷含量進(jìn)行定量測(cè)定，為建立猴頭菌絲固體培養(yǎng)物更完善的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器

WatersAlliance2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），配Waters2996PDA檢測(cè)器，Empower色譜工作站；TU⁃1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；CPA225D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；CorningLES離心機(jī)（美國(guó)康寧公司）；TGL⁃18C⁃C高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；HH⁃2K2二孔智能水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；KQ⁃500DE超聲機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；SynergyUV超純水器（上海默克密理博公司）。

1.2試藥

硅膠G型薄層板（青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng)，批號(hào)：20150120）；對(duì)照品：腺苷（批號(hào)：110879⁃200202）、亮氨酸（批號(hào)：110876⁃200204）、甘氨酸（批號(hào)：110735⁃200102）、組氨酸（批號(hào)：890⁃200001）、蘇氨酸（批號(hào)：889⁃200102）、纈氨酸（批號(hào)：140681⁃201202）、無(wú)水葡萄糖（批號(hào)：110833⁃201205），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；猴頭菌絲固體培養(yǎng)物對(duì)照藥材（自制，批號(hào)：20151108，腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)：0.182mg／g）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；10批猴頭菌絲固體培養(yǎng)物樣品均由南京老山藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院郭青教授鑒定為猴頭菌絲發(fā)酵后培養(yǎng)基與菌絲的復(fù)合體，批號(hào)如下：1（140113），2（140316），3（141026⁃1），4（141104⁃2），5（20141108），6（141122⁃1），7（141122⁃2），8（141210⁃2），9（150603），10（150703）。

2方法結(jié)果

2.1猴頭菌絲固體培養(yǎng)物TLC鑒別［10］

取本品1g，加70％（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇30mL，加熱回流30min，濾過(guò)，濾液濃縮至約5mL作為供試品溶液。另取猴頭菌絲固體培養(yǎng)物對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取甘氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸對(duì)照品適量，分別加70％乙醇制成每1mL各含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。參照2015年版《中國(guó)藥典》四部“通則0502薄層色譜法”試驗(yàn)，吸取供試品溶液與對(duì)照藥材溶液各3μL、對(duì)照品溶液各1μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇⁃冰醋酸⁃水（體積比8∶3∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2％茚三酮乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2檢查

2.2.1水分

取各批樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）約2g，精密稱(chēng)定，參照2015年版《中國(guó)藥典》四部“通則0832水分測(cè)定法第二法”進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果測(cè)得10批樣品的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在6.48％～10.47％之間，平均為8.89％。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，暫定水分不得過(guò)11.0％，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2水溶性浸出物、醇溶性浸出物

取各批樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約2g，精密稱(chēng)定，參照2015年版《中國(guó)藥典》四部“通則2201浸出物測(cè)定法”進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果測(cè)得10批樣品的水溶性浸出率在13.73％～17.81％之間，平均為15.37％；醇溶性浸出率在4.63％～6.50％之間，平均為5.64％，見(jiàn)表1。根據(jù)以上結(jié)果，暫定水溶性浸出率不得低于12.3％，醇溶性浸出率不得低于4.5％。

2.2.3總灰分、酸不溶性灰分

取各批樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約3g，精密稱(chēng)定，參照2015年版《中國(guó)藥典》四部“通則2302總灰分測(cè)定法、酸不溶性灰分測(cè)定法”進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果測(cè)得10批樣品的總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3.86％～6.86％之間，平均為5.16％；樣品酸不溶性灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.76％～2.02％之間，平均為1.16％，見(jiàn)表1。根據(jù)以上結(jié)果，暫定總灰分不得超過(guò)6.5％，酸不溶性灰分不得超過(guò)1.5％。

2.3UV⁃VIS測(cè)定猴頭菌絲固體培養(yǎng)物中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3.1對(duì)照品溶液的制備

取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水制成每1mL含0.2005mg的溶液，即得。

2.3.2供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約0.2g，精密稱(chēng)定，置50mL離心管中，加80％（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇30mL，超聲30min（工作頻率40kHz，功率250W），離心15min（轉(zhuǎn)速6000r／min）后棄去上清液，再加80％乙醇30mL重復(fù)1次。用50mL水將濾渣移至圓底燒瓶中，加熱回流1h，趁熱濾過(guò)，用30mL熱水分3次洗滌濾渣及濾紙，濾液收集至100mL量瓶中，冷卻后加水定溶至刻度，搖勻，即得。

2.3.3線(xiàn)性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL，分別置10mL具塞試管中，各加水至2.0mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液5mL，立即搖勻，水浴中放置10min后，立即置冰浴中冷卻10min，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，參照2015年版《中國(guó)藥典》“通則0401紫外⁃可見(jiàn)分光光度法”在626nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得多糖回歸方程Y＝11.232X＋0.0188（r2＝0.9992），線(xiàn)性范圍為20.1～70.2μg／mL。

2.3.4精密度試驗(yàn)

取葡萄糖對(duì)照品溶液稀釋5倍，精密吸取6份，按“2.3.3”項(xiàng)下測(cè)定方法分別測(cè)定吸光度，結(jié)果得RSD值為0.70％，表明儀器精密度良好。

2.3.5重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品粉末（樣品5）6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下測(cè)定方法分別測(cè)定吸光度，結(jié)果得RSD值為0.95％，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品供試品溶液（樣品5），分別于0、10、20、40、60、90、120min測(cè)定吸光度，結(jié)果得RSD為0.60％，表明樣品在2h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7加樣回收率試驗(yàn)

分別精密量取9份本品供試品溶液（樣品5），每份1000μL，分別精密添加葡萄糖對(duì)照品溶液160、200、240μL各3份，加水補(bǔ)至2mL，混勻，按“2.3.3”項(xiàng)下測(cè)定方法分別測(cè)定吸光度，計(jì)算得平均加樣回收率為100.65％，RSD為1.44％。

2.3.8樣品中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

分別測(cè)定了10個(gè)批次猴頭菌絲固體培養(yǎng)物中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每批平行3份。結(jié)果測(cè)得10批樣品的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.05％～3.43％之間，平均為2.79％，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)10批樣品的測(cè)定結(jié)果，暫定本品含多糖不得低于2.23％。

2.4HPLC法測(cè)定猴頭菌絲固體培養(yǎng)物中腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.4.1色譜條件

色譜柱：Kromasil100⁃5C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈⁃水（體積比5∶95）；流速：1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：30℃。色譜圖見(jiàn)圖3。

2.4.2對(duì)照品溶液的制備

取腺苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含20.32μg的溶液，即得。

2.4.3供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約0.5g，研細(xì)，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入45％（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇25mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲40min（頻率40kHz，功率250W），放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用45％甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4線(xiàn)性關(guān)系考察

精密量取腺苷對(duì)照品溶液，以2倍法稀釋后續(xù)對(duì)照品溶液，得質(zhì)量溶度為20.32、10.16、5.08、2.54、1.27μg／mL系列溶液，分別吸取上述溶液20μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得腺苷回歸方程為Y＝64281X－941.45（r2＝1.0000），線(xiàn)性范圍為1.27～20.32μg／mL。

2.4.5精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄每次所測(cè)峰面積。結(jié)果得峰面積的RSD值為0.07％，表明儀器精密度良好。

2.4.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品粉末6份（樣品6），按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果樣品中腺苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為0.95％，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品粉末（樣品6），按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、18、24h進(jìn)樣，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定記錄峰面積。結(jié)果得峰面積的RSD為2.59％，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批本品粉末（樣品6）6份，每份約0.25g，精密稱(chēng)定，精密加入質(zhì)量濃度為20.32μg／mL的對(duì)照品溶液2.650mL，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定記錄峰面積。結(jié)果計(jì)算得平均回收率為100.8％，RSD為1.27％。

2.4.9耐用性試驗(yàn)

比較了3根不同品牌的高純度硅膠鍵合C18柱：①Kromasil100⁃5C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；②HederaODS⁃2柱（4.6mm×250mm，5μm）；③WelchromC18柱（4.6mm×250mm，5μm）。取同一份供試品溶液（樣品6），分別于上述3根色譜柱上進(jìn)樣，3種不同品牌色譜柱測(cè)得的猴頭菌絲固體培養(yǎng)物中腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為1.41％（n＝3）。

2.4.10樣品中腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

分別測(cè)定了10個(gè)批次猴頭菌絲固體培養(yǎng)物中腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每批平行3份，結(jié)果測(cè)得10批樣品的腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.0070％～0.0317％之間，平均為0.0154％，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)10批樣品的測(cè)定結(jié)果，暫定本品含腺苷不得低于0.0123％。

3討論

本試驗(yàn)在TLC鑒別中對(duì)樣品的提取方法、點(diǎn)樣量、展開(kāi)劑種類(lèi)、溶劑比例等條件進(jìn)行了篩選，最終確定了鑒別方法。從本文結(jié)果可見(jiàn)，10批猴頭菌絲固體培養(yǎng)物的TLC圖在與對(duì)照品、對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，均出現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)。多糖是猴頭菌絲固體培養(yǎng)物的主要成分之一，本文對(duì)樣品的提取方法、提取時(shí)間、料液比、顯色方法、硫酸蒽酮濃度及其加入量和顯色時(shí)間等條件進(jìn)行了考察，最終確定了多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法。核苷類(lèi)成分為猴頭菌的主要成分之一，具有鎮(zhèn)靜、擴(kuò)血管、抗缺氧及較弱的抗感染、降膽固醇等生理活性，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高［11］，因此選擇腺苷作為指標(biāo)性成分。10批樣品的測(cè)定結(jié)果表明，腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較穩(wěn)定，這表明腺苷可以作為一個(gè)穩(wěn)定的控制因子，與多糖一起成為復(fù)合式的分析指標(biāo)。猴頭菌絲固體培養(yǎng)物已在廣泛使用，但其當(dāng)前的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)還不是很完善，因此建立簡(jiǎn)單快速考察猴頭菌絲固體培養(yǎng)物的質(zhì)量方法具有重要意義。根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際，參照“《中國(guó)藥典》中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求”有關(guān)規(guī)定，結(jié)合原料藥與猴頭菌絲固體培養(yǎng)物成藥胃樂(lè)寧片的實(shí)際情況，本次質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的上限標(biāo)準(zhǔn)按平均量上浮20％制訂，下限標(biāo)準(zhǔn)按平均量下浮20％制訂。本研究建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為全面控制猴頭菌絲固體培養(yǎng)物的質(zhì)量提供了可靠的方法。

參考文獻(xiàn)：

［1］王曉玉，蔣秋燕，凌沛學(xué)，等.猴頭菌活性成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2010，31（1）：70⁃72.

［2］尚曉冬，王國(guó)艷，潘偉，等.猴頭菌小分子活性成分研究進(jìn)展［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2012，19（1）：79⁃91.

［8］張鵬，圖力古爾，包海鷹.猴頭菌屬真菌化學(xué)成分及藥理活性研究概述［J］.菌物研究，2011，9（1）：54⁃62.

［10］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2015年版一部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1614.

［11］中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中草藥現(xiàn)代研究：第一卷［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1995：91⁃103.

作者:畢春洋 李國(guó)源 陳婷 芮天奇 楊軍輝 李俊松 單位:南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心