蘋果牛眼果腐病菌的檢疫鑒定范文

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《植物檢疫雜志》2016年第一期

摘要

對來自美國的蘋果進行了病原菌分離，結果在果實中分離到1株疑似蘋果牛眼果腐病菌的菌株Nk-2968。對其進行了病原菌形態學觀察、致病性測定并結合分子生物學方法檢測，實驗結果表明，菌株Nk-2968在PDA培養基上生長良好，能產生大量的分生孢子；經真菌通用引物（ITS4/ITS5）及β-tubulin引物分別擴增和測序，菌株Nk-2968與GenBank中登錄號AF281462.1、HG793110.1和HG793112.1的菌株序列同源性達到100%；病菌接種蘋果8d后開始發病。根據上述實驗結果，將分離獲得的菌株Nk-2968鑒定為蘋果牛眼果腐病菌（Neofabraeakienholzii）。這是我國口岸首次在進境的蘋果果實上截獲該危險性有害生物。

關鍵詞

蘋果牛眼果腐病菌；形態特征；分子檢測；致病性測定；鑒定

蘋果牛眼果腐病菌，屬于子囊菌門（Ascomycota），盤菌亞門，錘舌菌綱，柔膜菌目（Helo-tiales），皮盤菌科（Dermataceae），明孢盤菌屬（Neo-fabraea）。無性世代為Cryptosporiopsiskienholzii。它與我國口岸多次在進境蘋果中所截獲的其他3種蘋果牛眼果腐病菌（Neofabraeamalicorticis，N.perennans和N.alba）互為近似種。Neofabraeakienholzii在進境蘋果果實上的截獲尚屬首次，是一種危險性的有害生物。蘋果牛眼果腐病的病原菌以往一直被認為是Peziculaspp.，1999年起公認Neofabraea為病原菌的正確屬，將Peziculaspp.歸入Neofabraeaspp.［1］。蘋果牛眼果腐病菌可侵染多種果樹，如蘋果、梨、杏、山楂、溫桲、桃、唐棣（藍莓）等。蘋果中所有品種均感病，果實腐爛率可達40%。病菌不僅侵害蘋果等果實，產生牛眼狀的爛果，在儲存期危害較重，病菌還可侵染樹木的枝干和枝條而導致樹皮發生潰瘍，甚至枝條枯死，幼樹死亡，故又稱蘋果樹炭疽潰瘍病菌和蘋果多年生潰瘍病菌。蘋果牛眼果腐病菌主要分布在北美、歐洲（丹麥、荷蘭、葡萄牙）、新西蘭、澳大利亞等國家，我國未見該病菌的發生為害報道［2］。2015年8月，上海出入境檢驗檢疫局植檢實驗室從美國進境的蘋果果實上通過分離培養獲得了一疑似蘋果牛眼果腐病菌的菌株Nk-2968，采用形態學特征、分子生物學檢測和致病性測定等方法對其進行了種類鑒定，證實從蘋果果實上分離到的菌株Nk-2968為蘋果牛眼果腐病菌。這是我國口岸首次在進境的蘋果果實上截獲該危險性有害生物。

1材料與方法

1.1材料、試劑和儀器材料：病原菌分離材料為美國進境的蘋果果實；致病性測定接種材料為健康蘋果。試劑：植物總DNA提取試劑盒，PCR反應試劑，DL2000DNAmarker，瓊脂糖，常規PDA培養基。儀器：超凈工作臺，立體顯微鏡），顯微鏡（ZEISSImager.M1），PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統。

1.2病原菌的分離培養與純化用75%酒精消毒病果表面，在病健交界處挖取少許果肉置于PDA培養基上，于23℃黑暗條件下培養。觀察病菌菌落的生長情況，對長出的菌落及時移取，置于新的PDA平板上純化培養。

1.3病原菌形態鑒定分別觀察和記錄病菌菌落在PDA平板上的形態、顏色變化和氣生菌絲的疏密程度。在立體顯微鏡和顯微鏡下分別觀察病原菌在分離純化培養過程中所形成的分生孢子，使用ZEISSAxioCamMRc5數碼攝像頭配合AxioVisionRel.4.5軟件拍攝其形態并測量其大小，根據病菌的形態特征進行鑒定。

1.4分子檢測

1.4.1菌絲DNA提取用滅菌挑針刮取PDA平板上培養7d的菌株菌絲體，按植物總DNA提取試劑盒說明書所述，提取該病菌的DNA，提取后將DNA保存于-20℃冰箱，備用。

1.4.2DNA擴增分別采用真菌通用引物ITS4/ITS5（上游引物為：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，下游引物為：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和根據β-tubulin基因設計的引物Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo（上游引物為：5'-CAACTGGGCTAAGGGTCATT-3'，下游引物為：5'-GTGAACTCCATCTCGTCCATA-3'）對菌株Nk-2968基因組DNA進行PCR擴增。反應體系為：10×buffer2.5μL、Mg2+2.0μL（25mmol/L）、dNTP0.5μL（10mmol/L）、上下游引物各0.5μL（20μmol/L）、DNA3μL、rTaq0.3μL（5U/μL），滅菌水補足至25μL。采用通用引物ITS4/ITS5的PCR反應條件：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃復性30s，72℃延伸1min，35個循環的擴增；72℃延伸7min后，保存于4℃。采用引物Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo的PCR反應條件：94℃預變性3min；94℃變性1min，65℃復性1min，72℃延伸1.5min，35個循環的擴增；72℃延伸7min后，保存于4℃。1.4.3PCR產物序列分析將所得PCR產物送往上海生工生物工程有限公司進行雙向序列測定，對測序獲得的序列進行拼接并在GenBank中Blast，進行序列分析。

1.5病菌的致病性測定選取20個健康無傷的新鮮蘋果，先用75%的酒精對其進行表面消毒，然后在果皮部針刺出傷口，做好記號，再用滅菌挑針挑取適量PDA平板上純化培養的菌絲，將其接種在傷口上，最后用無菌水接種作為對照。用濕潤的滅菌脫脂棉覆蓋住傷口，將接種后的蘋果分別放入無菌塑料袋中，并放置在23℃黑暗條件下保濕培養。觀察記錄發病情況，并對發病果進行病菌再分離。

2結果與分析

2.1病原菌形態特征在23℃的培養條件下，菌株Nk-2968在PDA上培養5~6d后有乳白色的菌絲產生，菌落圓形，邊緣較整齊，氣生菌絲較少。后期，病菌的菌落顏色逐漸加深，背面呈橄欖綠色（圖1：A）。將在PDA培養基上獲得的純化病菌置于黑暗條件下，13d后開始產生無色透明的大型分生孢子和小型分生孢子（圖1：B）。大型分生孢子長橢圓形，大多直，個別稍彎曲，小型分生孢子長橢圓形。經過測量，大分生孢子大小為15.67~11.48μm×3.94~2.51μm，平均大小13.22μm×3.36μm；小分生孢子大小為7.04~4.51μm×3.11~1.93μm，平均大小5.8μm×2.23μm。

2.2分子測定及序列分析用真菌的通用引物ITS4/ITS5對菌株Nk-2968的DNA序列進行擴增，經雙向測序和拼接，將其在GenBank中通過Blast進行比對。結果表明，菌株Nk-2968的核苷酸序列與已報道的蘋果牛眼果腐病菌（N.kienholzii）2個菌株的同源性最高，達到99%以上。從關系樹上可以看出，菌株Nk-2968與N.kienholzii的2個菌株形成一簇，而與Neofabraea的其他近似種關系較遠（圖2）。用β-tubulin引物Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo對菌株Nk-2968的DNA序列進行擴增，經雙向測序和拼接，將其在GenBank中通過Blast進行比對。結果表明，菌株Nk-2968的核苷酸序列與已報道的蘋果牛眼果腐病菌（N.kienholzii）的同源性最高，與其中的3個菌株（序列登錄號：AF281462.1，HG793110.1和HG793112.1）的同源性達到100%。從關系樹上可以看出，菌株Nk-2968與N.kien-holzii的3個菌株形成一簇，而與Neofabraea的其他近似種關系較遠（圖3）。

2.3致病性測定用菌株Nk-2968接種蘋果，觀察發病癥狀。結果表明，接種蘋果果實8d后，接種部位開始出現褐腐癥狀，病斑邊緣與健康組織界限清晰，隨著接種時間加長，發病部位褐腐病斑逐漸擴大，腐爛加重。未接種病菌的對照則未出現上述癥狀（圖4：A）。對上述接種病菌的蘋果發病部位進行病菌再分離，結果分離后的病菌菌落性狀與接種病菌的特征完全一致，即培養初期有乳白色的菌絲產生，菌落圓形，邊緣較整齊，氣生菌絲較少（圖4：B）。致病性測定結果表明，該菌株可以侵染蘋果果實。

2.4結論通過對蘋果果實分離到的菌株Nk-2968的病原菌形態學觀察、分子檢測和致病性測定，認為2015年8月上海口岸從美國進境的蘋果腐爛果實中分離的病原真菌Nk-2968為蘋果牛眼果腐病菌（Neofabraeakienholzii）。

3討論

N.kienholzii與2007年中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄中公布的檢疫性有害生物Peziculamalicorticis（Jacks.）Nannfeld（即N.mal-icorticis）互為近似種，國內未見發生報道。國內外學者對該病菌研究得很少，一般主要研究的是Neo-fabraeamalicorticis，N.perennans和N.alba這3個種。由于N.kienholzii與上述3種已命名的蘋果牛眼果腐病菌在病菌形態特征上較為相似，且該種的不同株系在病菌的培養性狀上也存在較大差異，因此，直到2009年，Robert等才命名了這個新種Cryptosporiopsiskienholzii（有性型為Neofabraeakienholzii），并較為詳細地報道了N.kienholzii的菌落特征、分生孢子的形態和大小等［3］。本研究中分離到的菌株Nk-2968的菌落特點及孢子大小、形態等，與該報道結果基本一致。本研究采用病原菌形態學結合分子檢測和致病性測定的方法，分離并鑒定了美國進境的蘋果果實中所攜帶的蘋果牛眼果腐病菌（N.kienholzii）。本實驗用真菌通用引物ITS4/ITS5對菌株Nk-2968的DNA進行PCR擴增及對產物進行雙向測序拼接后，發現所得序列與N.kienholzii及其近似種的序列同源性均可達到99%，無法有效區分。國內外相關文獻中也有報道，由于Neofabraeaspp.的ITS區序列相似性高，有時難以用該區段的核苷酸序列來鑒別不同的種［4］。為此，國外學者James研究了該屬β-tubulin基因序列，發現在該保守區段內，Neo-fabraeaspp.種與種之間的差異更明顯［5］。本實驗采用根據β-tubulin基因設計的引物對菌株Nk-2968的DNA序列進行擴增、測序。序列分析結果表明，該菌株與GenBank中的N.kienholzii序列同源性可達100%，進一步確認了病原菌形態學的鑒定結果。致病性測定結果表明，該菌株能夠侵染蘋果果實。以上實驗結果均支持將此菌株鑒定為蘋果牛眼果腐病菌（N.kienholzii）。此為全國首次從國外進境的蘋果果實中截獲該危險性有害生物。

蘋果牛眼果腐病菌可侵染多種果樹，它不僅侵害果實，還可侵染樹木的枝干和枝條，導致樹皮發生潰瘍，甚至是枝條枯死，幼樹死亡。而蘋果牛眼果腐病菌對氣候條件的適應性強，可通過水果貿易和苗木調運進行異地及跨國傳播，儲運期間冷藏溫度下病菌仍能擴展。一旦該病菌隨蘋果果實傳入我國，其定殖傳播為害的風險性較高，將會對農林業和果樹生產造成難以估量的損失。因此，對于來自疫區的寄主植物的苗木、枝條、葉及果實等，應當給予高度重視，并且加大查驗力度，防止蘋果牛眼果腐病菌的傳入，保護我國的農林業安全生產。

作者：張露茜 胡培龍 李薇 于子翔 焦彬彬 易建平 于翠 楊翠云 單位：上海出入境檢驗檢疫局