槲皮素改性脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)的探究范文

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摘要：采用不同濃度的槲皮素（QCT）交聯(lián)改性脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)（pADM），并對(duì)改性后的脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)（QCT-pADM）材料進(jìn)行傅里葉紅外光譜、DSC、TG、表面形貌和耐降解性能等表征。結(jié)果顯示，槲皮素的引入不會(huì)改變pADM中膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)；改性后脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)材料纖維編織更為緊實(shí)，熱穩(wěn)定性能得到提升，耐酶解性能和親水性能大幅提高。

關(guān)鍵詞：槲皮素；脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)；交聯(lián)

前言

脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)（Porcineacellulardermalmatrix，pADM）是通過(guò)物理、化學(xué)、生物學(xué)等方法將豬真皮組織去除皮內(nèi)具有免疫原性的全部細(xì)胞成分后得到的一種膠原材料，其保留了組織中的膠原（纖維）成分和組織基本結(jié)構(gòu)且具有三維空間結(jié)構(gòu)。pADM具有良好的生物相容性、可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖、生物降解性優(yōu)良等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域獲得日益廣泛的應(yīng)用，但力學(xué)性能不足、耐降解性能差等缺點(diǎn)限制了其發(fā)展。因此，對(duì)pADM的適當(dāng)改性尤為重要?；瘜W(xué)交聯(lián)可在一定程度上封閉pADM的抗原位點(diǎn)，降低pADM的免疫原性，常用的化學(xué)交聯(lián)劑有戊二醛、碳化二亞胺、環(huán)氧化合物、京尼平等[1-3]。然而，化學(xué)交聯(lián)劑可能因?yàn)榉磻?yīng)不完全或純度不夠而向材料中引入一定的雜質(zhì)使得材料生物相容性下降。天然的提取產(chǎn)物可避免化學(xué)交聯(lián)劑毒性較大等問(wèn)題。肖世維等[4]采用原花青素對(duì)pADM進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)后材料的機(jī)械力學(xué)性能增強(qiáng)，熱變性溫度升高，親水性能增加，同時(shí)材料無(wú)明顯急性毒性。槲皮素（Quercetin，QCT）是一種類黃酮醇，微溶于水，溶于乙醇、冰醋酸等溶劑中，以糖苷形式存在于蔬菜、瓜果等植物中。槲皮素獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)使其具有多面的藥理功能和生物活性，具有抗菌消炎作用、抗氧化作用、抗腫瘤作用等[5]。槲皮素與原花青素分子結(jié)構(gòu)類似，僅在4位多1個(gè)O原子（羰基O），具有鄰苯二酚、間苯二酚結(jié)構(gòu)。呂昔琴等[6]采用槲皮素對(duì)心臟瓣膜進(jìn)行交聯(lián)改性，改性的材料力學(xué)性能得到明顯提升，耐酶降解性能和細(xì)胞相容性提高，同時(shí)材料具有很強(qiáng)的抗鈣化能力。但以槲皮素作為天然交聯(lián)劑交聯(lián)pADM還未有報(bào)道。本文主要采用不同濃度的槲皮素對(duì)脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)改性，旨在了解槲皮素對(duì)pADM結(jié)構(gòu)和性能的影響，以探討槲皮素作為pADM交聯(lián)劑的可能性。

1試驗(yàn)部分

1.1主要儀器及試劑

1.1.1主要儀器精密分析天平（FA2004N），上海菁海儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)（Freeze6），Labconco公司；萬(wàn)能電子拉力機(jī)（GT-AL-7000S），高鐵檢測(cè)儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（NicoletIS10），美國(guó)ThermoScientific；差示掃描量熱儀（DSC-200PCPHOX），Netzsch公司；掃描電子顯微鏡（S3000N），Hitachi公司；熱重分析儀（TG209F1），Netzsch公司；超聲波清洗器（KH5200DE），昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.1.2主要試劑脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)，江陰奔翔生物科技有限公司；槲皮素，BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；茶樹油，BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；I型膠原酶，BR，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；其他試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1QCT-pADM材料制備準(zhǔn)確稱取400mg槲皮素（QCT）溶解于20mL無(wú)水乙醇中，超聲15min，得到均一溶液；然后用無(wú)水乙醇分別配制成1、2.5、5、10和20mg/mL溶液；準(zhǔn)確稱取2g脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)（pADM）分別浸在QCT溶液中，在37℃、持續(xù)搖動(dòng)的條件下（r/min=120）進(jìn)行交聯(lián)24h；反應(yīng)結(jié)束后，將其用蒸餾水清洗5次后，冷凍干燥，制得QCT-pADM材料。1.2.2QCT-pADM材料性能表征

1.2.2.1傅里葉變換紅外分析分別刮取少量QCT-pADM纖維，與適量KBr共混，研磨均勻后壓片，在傅里葉變換紅外光譜分析儀上進(jìn)行掃描。掃描條件為：4000~400cm-1范圍內(nèi)掃描32次，分辨率4cm-1，檢測(cè)環(huán)境25℃，相對(duì)濕度±65%。

1.2.2.2熱變性溫度測(cè)定采用差示掃描量熱分析儀（DSC）檢測(cè)了脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)在槲皮素處理前后的熱變性溫度。分別取膠原樣品3～5mg，密封于DSC坩堝中，以空坩堝作參比，用氮?dú)庾鳂悠肥冶Ｗo(hù)氣，從10℃加熱到120℃，升溫速度為10℃/min[7]。

1.2.2.3熱重分析分別稱取質(zhì)量2~5mg的QCT-pADM，于熱重分析儀上進(jìn)行檢測(cè)，記錄質(zhì)量隨溫度的變化。檢測(cè)溫度范圍50~800℃，升溫速率20k/min，氮?dú)獗Ｗo(hù)60mL/min。1.2.2.4表面形貌觀察取一定量的QCT-pADM樣品，將其浸入液氮后折斷，對(duì)斷面和表面噴金處理，置于掃描電鏡下，在加速電壓20kV的條件下，放大不同倍數(shù)觀察。

1.2.2.5耐酶解性能測(cè)試干燥后的QCT-pADM材料裁剪為正方形，稱重（W1），將其加入含5U/mL、5mL膠原酶/PBS溶液的比色管中，在37℃的搖床中降解，隔天換降解酶液。樣品在特定的時(shí)間點(diǎn)被取出用蒸餾水清洗5次后，凍干稱量（W2）。降解速率用以下公式計(jì)算：降解速率（%）=[(W1-W2)/W2]×100%。

1.2.2.6接觸角檢測(cè)采用視頻接觸角測(cè)定儀對(duì)膜材料進(jìn)行表面親疏水性檢測(cè)，將5μL煮沸冷卻的蒸餾水緩慢地滴在樣品表面，記錄液滴與膜材料接觸瞬間的圖像，然后計(jì)算接觸角，每個(gè)膜材料至少測(cè)定5個(gè)不同的表面區(qū)域，結(jié)果取平均值。

2結(jié)果與討論

2.1QCT-pADM傅里葉變換紅外分析紅外光譜特征酰胺吸收峰可直接反映天然I型膠原特殊的三股螺旋構(gòu)象。1650cm-1處為膠原的酰胺I帶的吸收峰，歸因于膠原分子中的C=O伸縮振動(dòng)；1545cm-1處為膠原酰胺II帶的吸收峰，歸因于N-H的彎曲振動(dòng)和C—N的伸縮振動(dòng)耦合作用，膠原的酰胺I、II帶與其二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α螺旋、β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)直接相關(guān)[8]。1235cm-1左右處的吸收峰為酰胺III帶，歸因于N—H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)和酰胺鍵內(nèi)C—N拉伸，以及主鏈—CH2基團(tuán)和側(cè)鏈的甘氨酸和脯氨酸擺動(dòng)振動(dòng)協(xié)同產(chǎn)生的吸收峰[9]，酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶可直接反映膠原分子內(nèi)部的有序性。在3410cm-1的酰胺A帶和3082cm-1的酰胺B帶兩個(gè)吸收帶歸因于N—H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)[10]。圖1是QCT-pADM材料的FT-IR圖。如圖1所示，經(jīng)不同濃度QCT改性的pADM材料的酰胺帶吸收峰幾乎未發(fā)生變化，說(shuō)明膠原骨架的三股螺旋結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變。

2.2差式掃描量熱（DSC）分析圖2為不同濃度QCT改性pADM材料的DSC圖。圖譜中位于20~40℃之間的小峰稱為預(yù)變性峰，代表膠原分子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度的松弛，從螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的一個(gè)預(yù)先轉(zhuǎn)變狀態(tài)[11]。60~85℃之間的峰則為膠原的熱變性溫度峰，此時(shí)膠原結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)變，其三股螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞。由圖可見，未經(jīng)改性時(shí)pADM的熱變性溫度為65.7℃，QCT質(zhì)量濃度為1、2.5、5、10、20mg/mL時(shí)，材料的熱變性溫度分別為73.8、75.9、78.6、81.2、83.3℃。由此可見，隨著QCT濃度增加，QCT-pADM材料的熱變性溫度也得以提升?？赡艿脑蚴荙CT結(jié)構(gòu)中含有的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)可與膠原的氨基、羥基等官能團(tuán)發(fā)生較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合，約束了膠原肽鏈之間的活動(dòng)，使材料發(fā)生相轉(zhuǎn)變的難度逐漸增大。因此QCT-pADM材料的熱變性溫度升高，濕熱穩(wěn)定性也隨之提升。

2.3熱重（TG）分析TG可用來(lái)表征材料在升溫過(guò)程中的失重現(xiàn)象，為進(jìn)一步研究QCT-pADM材料的熱穩(wěn)定性，對(duì)材料進(jìn)行了熱重分析。一般而言，在50~150℃范圍內(nèi)，主要發(fā)生膠原分子內(nèi)氫鍵的斷裂，由膠原纖維內(nèi)的水分揮發(fā)或雜質(zhì)分解引起質(zhì)量損失，在200~800℃范圍內(nèi)，膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)與多肽鏈骨架被破壞[12]。圖3為不同用量交聯(lián)的QCT-pADM的熱重曲線。由圖3可見，各組樣品均具有相同的失重現(xiàn)象。隨著QCT用量增加，材料的殘留質(zhì)量亦呈現(xiàn)出增加趨勢(shì)。不同QCT用量交聯(lián)的QCT-pADM的熱重曲線的一次微分曲線。通常認(rèn)為，微分曲線的峰值為材料質(zhì)量損失最快時(shí)的熱分解溫度。由圖4可見，隨著QCT用量的增加，QCT-pADM材料的微分曲線峰值均向較高溫方向移動(dòng)?？赡艿脑蚴荙CT結(jié)構(gòu)中含有的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)可與膠原的氨基、羥基等官能團(tuán)發(fā)生較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合，約束了膠原肽鏈之間的活動(dòng)，使材料發(fā)生相轉(zhuǎn)變的難度逐漸增大，因此使得材料的熱穩(wěn)定性升高。TG分析結(jié)果與DSC熱變性溫度結(jié)果一致，說(shuō)明QCT與pADM的交聯(lián)能提高材料的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

2.4表面形貌觀察pADM的主要成分為I型膠原。正如所知，pADM是一種由膠原分子、膠原原纖維、膠原纖維、膠原纖維束逐級(jí)構(gòu)成的一種多層級(jí)膠原聚集體，纖維之間存在許多無(wú)規(guī)則的間隙。交聯(lián)會(huì)在膠原分子及纖維間形成新的化學(xué)鍵，將膠原纖維拉緊，使得材料輕微收縮，結(jié)構(gòu)變得緊實(shí)。天然pADM材料存在個(gè)體差異，無(wú)法切實(shí)確定材料交聯(lián)前后的空隙變化情況。圖5為不同QCT用量交聯(lián)的QCT-pADM掃描電子顯微鏡圖像。pADM內(nèi)膠原纖維束層層堆疊、交織在一起，縱橫交錯(cuò)，纖維孔隙明顯。圖6為經(jīng)不同用量QCT交聯(lián)后pADM的高倍SEM觀察圖。隨著QCT用量增加，pADM膠原纖維間隙逐漸變小，材料變得更加緊實(shí)?？梢?，QCT對(duì)pADM的交聯(lián)效果明顯，這也是QCT-pADM材料熱變性溫度得以提升的一個(gè)佐證，亦可根據(jù)需要選擇槲皮素用量，達(dá)到所需的交聯(lián)程度。

2.5耐酶解性能測(cè)試脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)的體外耐酶解性能較差，因此對(duì)交聯(lián)后QCT-pADM材料的耐酶解穩(wěn)定性檢測(cè)尤為重要。pADM的主要成分為I型膠原，故選擇I型膠原酶對(duì)QCT-pADM進(jìn)行降解以表征其降解能力[13]。如圖7所示，脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)在1天的降解率為80%，2天后接近完全降解。經(jīng)1、2.5、5、10、20mg/mLQCT溶液交聯(lián)后的材料在酶液作用2天后降解率分別為20.10%、6.78%、6.77%、7.61%、7.06%；10天后降解率分別為73.71%、30.67%、25.86%、21.35%、18.23%。20天后經(jīng)1mg/mLQCT溶液交聯(lián)后的材料接近完全降解，經(jīng)2.5、5、10、20mg/mLQCT溶液交聯(lián)后的材料降解率分別為35.44%、28.75%、23.43%、20.70%。28天后，2.5mg/mLQCT溶液交聯(lián)后的材料降解率接近40%，最高濃度20mg/mLQCT溶液交聯(lián)后的材料降解率低于30%。由此可見，使用QCT交聯(lián)pADM可大幅提高材料的耐酶降解性能，且隨著QCT用量增加，pADM的耐酶解性能增強(qiáng)。材料抗酶解能力的提高可能得益于QCT結(jié)構(gòu)中的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)與pADM內(nèi)膠原分子內(nèi)和分子間以及微纖維間形成交聯(lián)與氫鍵，使得材料結(jié)構(gòu)更緊密，從而使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性大幅增強(qiáng)，耐酶解性能大幅提高。

2.6接觸角測(cè)試生物醫(yī)用材料的表面親疏水性能對(duì)其與組織和細(xì)胞之間的相互作用具有重要影響，良好的親水性能更有利于細(xì)胞在材料表面的粘附和增殖[14]。材料表面的接觸角（watercontactangle，WCA）測(cè)試可以直觀反映材料的親疏水性能，材料的WCA值以90°為界限，高于90°為疏水型材料，低于90°為親水型材料，并且WCA值越低，材料的親水性越好。為了表征QCT-pADM材料表面的親疏水性能，本實(shí)驗(yàn)采用視頻接觸角測(cè)定儀檢測(cè)了材料的接觸角。由圖8可知，未經(jīng)改性的pADM材料的接觸角為113.8°，親水性較差，可能的原因是pADM是膠原聚集體，結(jié)構(gòu)與膠原分子相較更封閉，暴露的親水基團(tuán)較少。而經(jīng)過(guò)不同濃度QCT溶液改性后，pADM材料表面的接觸角逐漸降低，且隨著QCT濃度升高而降低。說(shuō)明隨著QCT濃度升高，材料的親水性越來(lái)越好。分析原因，一方面可能是QCT分子中含有鄰苯羥基、間苯羥基、醚鍵等親水基團(tuán)，pADM經(jīng)QCT改性后，QCT接到了膠原纖維上，QCT分子中含有的親水基團(tuán)也引入到了pADM中，從而導(dǎo)致WCA降低，提高了材料表面的親水性。另一方面，由Wenzel方程可知，當(dāng)接觸角小于90°時(shí)候，固體表面的粗糙因子越大，接觸角就越小，表面親水性也就越高[15-16]。

3結(jié)論

本文用不同濃度的QCT溶液（1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL）對(duì)純pADM材料進(jìn)行改性，研究了槲皮素（QCT）對(duì)脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)（pADM）結(jié)構(gòu)和性能的影響。表征結(jié)果表明QCT與pADM之間的交聯(lián)作用對(duì)pADM的特征三股螺旋結(jié)構(gòu)影響很小，pADM膠原纖維間隙逐漸變小，材料變得更加緊實(shí)。同時(shí)，QCT改性pADM使其熱力學(xué)性能、耐酶解性能和親水性能顯著提升?？梢?，槲皮素可以作為脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)的一種新的交聯(lián)劑。

作者：龔居霞1,2；但衛(wèi)華1,2；但年華1,2 單位：1.四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.四川大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心