槲皮素對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響范文

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【摘要】目的：探討槲皮素對(duì)于人宮頸癌細(xì)胞SiHa的作用及機(jī)制。方法：用不同濃度的槲皮素（0、20、40和80μmol/L）處理SiHa細(xì)胞不同時(shí)間后（24h，48h和72h），通過噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化；通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)槲皮素對(duì)細(xì)胞周期的影響；通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Westernblotting）檢測(cè)槲皮素對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）表達(dá)的影響。結(jié)果：MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，槲皮素處理SiHa細(xì)胞24h和48h后，40μmol/L和80μmol/L組的細(xì)胞活力低于對(duì)照組（P＜0.05）；槲皮素處理SiHa細(xì)胞72h后，20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L組的細(xì)胞活力低于對(duì)照組（P＜0.05）；在40μmol/L和80μmol/L組，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活力較24h時(shí)降低（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，SiHa細(xì)胞經(jīng)過20、40和80μmol/L濃度的槲皮素分別處理48h后，處于G0/G1期的細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組。RT-PCR和Westernblotting結(jié)果顯示，槲皮素可以下調(diào)SiHa細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)。結(jié)論：槲皮素通過下調(diào)SiHa細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)，可以抑制SiHa細(xì)胞的活力和增殖。

【關(guān)鍵詞】槲皮素；宮頸腫瘤；細(xì)胞周期蛋白D1；細(xì)胞增殖

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，高居女性惡性腫瘤的第2位，而世界每年宮頸癌的新發(fā)病例為50多萬人，因罹患宮頸癌而死亡的病人有20多萬，是一種嚴(yán)重危害女性健康的惡性疾病[1]。槲皮素（quercetin，Que）廣泛分布于植物的果實(shí)、葉子以及花中，是一種天然的多羥基黃酮類化合物，具有很高的藥用價(jià)值，研究表明槲皮素具有多種藥理活性，包括抗炎癥、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)血脂、降血壓及保護(hù)心肌缺血再灌注等作用。目前研究表明，槲皮素不僅可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，還可以降低腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力，在多種惡性腫瘤具有抗腫瘤的生物學(xué)作用[2]。但是，槲皮素對(duì)人宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響目前還不清楚。因此，本研究通過使用槲皮素處理人宮頸癌SiHa細(xì)胞，研究槲皮素對(duì)人宮頸癌SiHa細(xì)胞的影響，并初步探討槲皮素在SiHa細(xì)胞中的作用機(jī)制，從而為槲皮素的臨床應(yīng)用提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

人宮頸癌SiHa細(xì)胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。槲皮素購于美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司，細(xì)胞周期蛋白D1鼠單克隆抗體和β-actin鼠單克隆抗體均購于美國SantaCruz公司，二甲基亞砜（DMSO）購于美國Sigma公司，噻唑藍(lán)（MTT）試劑購于美國Sigma公司，RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司，一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒、瓊脂糖購于美國TaKaRa公司，其余為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌SiHa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于含5%CO2的37℃孵箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每3～4d用胰酶消化，傳代1次。

1.2.2槲皮素的配置與實(shí)驗(yàn)分組

將槲皮素溶解于DMSO中配置成儲(chǔ)存母液，于-20℃冰箱保存。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，用DMEM培養(yǎng)基分別進(jìn)行稀釋，DMSO的最終濃度＜0.1%。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌SiHa細(xì)胞分為對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)基+DMSO，槲皮素濃度為0μmol/L）和實(shí)驗(yàn)組（槲皮素濃度分別為20、40和80μmol/L）。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌SiHa細(xì)胞通過胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，以3×104的細(xì)胞濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μL的DMEM培養(yǎng)基。次日，待細(xì)胞貼壁后,更換為含有不同濃度槲皮素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（槲皮素濃度分別為0、20、40和80μmol/L），分別培養(yǎng)24、48、72h后，吸棄各孔內(nèi)的培養(yǎng)基，分別加入100μL的MTT（5g/L），37℃孵育4h后吸棄各孔中的上清液，分別加入150μLDMSO，于搖床震蕩10min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處每孔的光密度值（OD），每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞活力的計(jì)算公式：細(xì)胞活力（%）＝（槲皮素組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌SiHa細(xì)胞通過胰酶消化后，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，次日待細(xì)胞貼壁后,更換為含有不同濃度槲皮素的DMEM培養(yǎng)基（槲皮素濃度分別為0、20、40和80μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)48h后，通過胰酶常規(guī)消化并收集各組細(xì)胞，1000r/min離心5min后，吸棄上清液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞2次后，加入預(yù)冷的70%的乙醇，于4℃冰箱固定細(xì)胞12h，之后1000r/min離心5min，PBS洗滌細(xì)胞2次，用含0.01%核糖核酸酶（RNase）的碘化丙啶（PI）染液處理細(xì)胞后，避光染色30min后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，通過CellQuest軟件分析結(jié)果，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5RT-PCR將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌

SiHa細(xì)胞通過胰酶消化后，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，次日待細(xì)胞貼壁后，更換為含有不同濃度槲皮素的DMEM培養(yǎng)基（槲皮素濃度分別為0、20、40和80μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集各組細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒提取總RNA，以CyclinD1引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，上游5′-GAACACCAGCTCCTGTGCT－GCG-3′；下游5′-TGTCCACGTCCCGCACGTT-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物大小為880bp。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法（Westernblotting）

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌SiHa細(xì)胞通過胰酶消化后，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，次日待細(xì)胞貼壁后,更換為含有不同濃度槲皮素的DMEM培養(yǎng)基（槲皮素濃度分別為0、20、40和80μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集各組細(xì)胞，分別加入細(xì)胞裂解液收集細(xì)胞蛋白，并測(cè)定各組細(xì)胞的蛋白濃度。將蛋白樣本與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別上樣于加樣孔，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜移至含5%的脫脂奶粉的Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（TBST）中室溫封閉1h，用TBST洗膜10min×4次。加入一抗，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜10min×4次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，TBST洗膜10min×4次，然后用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，于暗室中曝光。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析和單因素方差分析，2組樣本間的均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1槲皮素對(duì)人宮頸癌細(xì)胞SiHa的細(xì)胞活力影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，槲皮素處理SiHa細(xì)胞24h和48h后，40μmol/L和80μmol/L組的細(xì)胞活力低于對(duì)照組，槲皮素處理SiHa細(xì)胞72h后，20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L組的細(xì)胞活力低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在40μmol/L和80μmol/L組，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活力較24h時(shí)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2槲皮素對(duì)SiHa細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，SiHa細(xì)胞經(jīng)過20、40和80μmol/L濃度的槲皮素分別處理48h后，處于G0/G1期細(xì)胞的百分比分別為（58.46±1.58）%、（64.92±1.15）%和（71.50±1.18）%，與對(duì)照組（52.24±1.46）%相比均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。此外，SiHa細(xì)胞經(jīng)過20、40和80μmol/L濃度的槲皮素分別處理48h后，處于S期細(xì)胞的百分比分別為（35.48±0.91）%、（26.53±1.93）%和（21.96±0.33）%，與對(duì)照組（41.63±2.11）%相比均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3槲皮素對(duì)SiHa細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)的影響

RT-PCR和Westernblotting結(jié)果顯示，在使用不同濃度的槲皮素處理SiHa細(xì)胞48h后（槲皮素濃度分別為20、40和80μmol/L），SiHa細(xì)胞中CyclinD1在轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白水平的表達(dá)均出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3討論

槲皮素是一種廣泛分布于植物的果實(shí)、葉子以及花中的多羥基黃酮類化合物，目前在100多種中草藥中均可以檢測(cè)到槲皮素的存在，其主要的生物學(xué)功能包括抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎癥以及保護(hù)心血管等。研究表明，槲皮素對(duì)于多種惡性腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[3]。在乳腺癌中，槲皮素發(fā)揮雌激素樣的作用，可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[4-5]。在肝癌細(xì)胞中，槲皮素可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖[6-8]。而在結(jié)腸癌中，槲皮素可以通過上調(diào)p21和p27蛋白的表達(dá)，使人結(jié)腸腺癌細(xì)胞RKO的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制人結(jié)腸腺癌細(xì)胞RKO的增殖[9]。同樣的，在卵巢癌細(xì)胞中，槲皮素也可以阻止細(xì)胞周期從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[10]。本研究MTT的結(jié)果顯示，在槲皮素處理時(shí)間相同的條件下，隨著槲皮素濃度的增加，槲皮素對(duì)于SiHa細(xì)胞活力的抑制作用逐漸增強(qiáng)。

同樣的，在槲皮素濃度相同的條件下，隨著作用時(shí)間的增加，槲皮素對(duì)于SiHa細(xì)胞活力的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。因此，槲皮素可以抑制SiHa細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖。此外，通過流式細(xì)胞儀分析槲皮素處理后SiHa細(xì)胞中細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)SiHa細(xì)胞經(jīng)過20、40和80μmol/L濃度的槲皮素分別處理48h后，處于G0/G1期的細(xì)胞百分比與對(duì)照組相比均出現(xiàn)了增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而SiHa細(xì)胞經(jīng)過20、40和80μmol/L濃度的槲皮素分別處理48h后，處于S期的細(xì)胞百分比與對(duì)照組相比均出現(xiàn)了減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。可見，槲皮素可以阻滯細(xì)胞周期從G0/G1向S期的轉(zhuǎn)換，增加G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)減少S期的細(xì)胞數(shù)量，這些結(jié)果與槲皮素在結(jié)腸癌[10]以及卵巢癌[11]中所觀察到的可以阻滯腫瘤細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換的結(jié)果是一致的。

此外，通過檢測(cè)周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以下調(diào)SiHa細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)，隨著濃度的增加，槲皮素對(duì)CyclinD1表達(dá)抑制的作用出現(xiàn)了進(jìn)一步的加強(qiáng)。因此，結(jié)合MTT以及細(xì)胞周期的結(jié)果，推測(cè)槲皮素可以通過下調(diào)SiHa細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)，從而阻滯腫瘤細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，抑制SiHa細(xì)胞的增殖和活力。綜上所述，槲皮素可以抑制SiHa細(xì)胞的增殖和活力，而這種抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，但是槲皮素具體通過何種途徑實(shí)現(xiàn)其對(duì)CyclinD1表達(dá)的調(diào)控還有待進(jìn)一步的研究。

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作者：張欣；董春力；付麗麗；杜鵑；李少聞