淺析響應(yīng)面優(yōu)化提取龍眼愈傷組織工藝范文

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摘要：為提高龍眼愈傷組織中單寧的提取率，采用超聲波輔助浸提法，基于乙醇濃度（A）、超聲波功率（B）與提取時間（C）3個單因素試驗，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化設(shè)計，建立了龍眼愈傷組織單寧提取工藝。研究結(jié)果表明，龍眼愈傷組織中單寧的最佳提取條件為乙醇濃度61%、超聲波功率140W，提取時間54min，提取溫度60℃，在此工藝條件下，提取量為7.53mg•g-1。

關(guān)鍵詞：龍眼愈傷組織；單寧；超聲波法；工藝優(yōu)化；響應(yīng)面分析

龍眼（DimocarpuslonganLour）屬于無患子科龍眼屬，是我國著名的熱帶亞熱帶特色水果之一，也是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，素有“南方人參”的美譽，是國家衛(wèi)生部公布的法定藥食兩用植物，富含單寧、萜類、甾醇、多酚、類黃酮等多種次生代謝物質(zhì)［1⁃2］，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用功能。單寧又名植物多酚，廣泛存在于植物的皮、根、葉、核和果肉中，具有抗癌、抗腫瘤、抗艾滋病和降壓等功效［3⁃4］。近年來，關(guān)于各種植物單寧提取工藝研究的報道較多，單寧的常用提取方法有水浴提取法、超聲波輔助提取法、超臨界CO2萃取法、微波提取法等［5］。選擇適宜的提取方法，可提高單寧的提取量，提高植物利用率，降低成本。超聲波提取法相對于其他方法具有簡便快捷、提取溫度低、能耗低等優(yōu)點，是一種較理想的單寧提取方法，廣泛應(yīng)用于多種植物材料的提取［6⁃10］。根據(jù)植物細(xì)胞全能性理論，利用愈傷組織可生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物，例如多糖［11］，但對龍眼愈傷組織中單寧提取的研究尚未見報道。龍眼胚性愈傷組織能夠長期繼代培養(yǎng)，且在短時間內(nèi)就可以獲得大量材料［12⁃13］，通過龍眼愈傷組織提取單寧，不僅為單寧提取提供了新的來源，而且能夠提高龍眼的綜合利用價值。本研究以龍眼愈傷組織細(xì)胞為原料，對超聲波輔助提取單寧物質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，旨在探索一種快速、簡便、高效的龍眼愈傷組織細(xì)胞單寧提取方法，為工業(yè)化生產(chǎn)單寧奠定基礎(chǔ)、提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1試驗材料龍眼‘紅核子’（DimocarpuslonganLour.cv.Honghezi）胚性愈傷組織由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。將材料置于60℃電熱恒溫干燥箱中烘干，粉碎后過40目篩，密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法1.2.1樣品量的測定準(zhǔn)確稱取0.1000g單寧酸，溶解并定容1000mL，制成0.1mg•mL-1的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，置于盛有15.0mL蒸餾水的50.0mL試管中，搖勻；加Folin-Denis試劑2.0mL，搖勻；靜置6min后，再加入5.0mL飽和Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，搖勻，靜置避光顯色60min，以不加單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對照，在760nm處測其吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取粉碎好的龍眼愈傷組織粉末0.2000g，置于50mL試管中，加入60%的乙醇12mL，在超聲波功率120W、溫度60℃條件下超聲1h，過濾得到待測溶液，按上述方法測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的單寧量。1.2.2單寧量的結(jié)果計算單寧量=10-3×C×Vm×V0V1×100%，式中，C為顯色溶液的單寧濃度（μg•mL-1）；V為顯色溶液體積（mL）；V0為樣品提取液體積（mL）；V1為測定時吸取樣品溶液體積（mL）；m為龍眼愈傷組織質(zhì)量（g）。1.2.3精密度試驗準(zhǔn)確吸取0.1mg•mL-1的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，在760nm處測其吸光度，重復(fù)5次，求得RSD。1.2.4加標(biāo)回收率實驗準(zhǔn)確移取0.5mL同一樣品溶液5份，分別加入1.25mg單寧酸，在760nm處測其吸光度，重復(fù)5次，求得RSD。

1.3單因素試驗以乙醇作為提取溶劑，探討提取溶劑濃度、超聲波時間和超聲波功率對龍眼愈傷組織中單寧提取效果的影響。1.3.1提取溶劑濃度以乙醇為提取溶劑，研究不同濃度乙醇溶液對龍眼愈傷組織中單寧提取效果的影響。乙醇濃度設(shè)置為40%，50%，60%，70%，80%和90%共6個梯度，超聲波功率設(shè)置為120W，提取溫度60℃，超聲波提取60min，料液比1：60。每種處理設(shè)置重復(fù)3次。1.3.2超聲波提取時間超聲波功率120W，提取溫度60℃，乙醇溶液濃度為60%，料液比1：60，設(shè)置30，45，60，75和90min5個提取時間，研究不同提取時間對龍眼愈傷組織中單寧提取效果的影響。每種處理重復(fù)3次。1.3.3超聲波功率提取時間45min，提取溫度60℃，乙醇溶液濃度為60%，料液比1：60，設(shè)置超聲波功率為80，100，120，140和160W5個梯度，比較不同超聲波功率對龍眼愈傷組織中單寧提取效果的影響。每種處理重復(fù)3次。1.4響應(yīng)面試驗設(shè)計通過單因素試驗分析，應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken［14］設(shè)計原則，以乙醇濃度、超聲波功率和提取時間為3個影響因素，以單寧提取量為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，最終根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，確定龍眼愈傷組織單寧的最佳提取工藝，響應(yīng)面分析因素與水平見表1。

2結(jié)果與分析

2.1精密度試驗準(zhǔn)確吸取0.1mg•mL-1的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，在760nm處測其吸光度值，重復(fù)5次，求得RSD=0.0548%＜2.0%，表明儀器精密度良好。

2.2加標(biāo)回收實驗由表3可知，加標(biāo)回收試驗的平均回收率為99.84%，RSD為0.357%＜2.0%，說明該測定方法具有很好的準(zhǔn)確度。

2.3單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線以單寧酸濃度為橫坐標(biāo)（x），測得的吸光值（A）為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=67.683x+0.0063（R2=0.9991），呈現(xiàn)良好的線性。

2.4單因素試驗對龍眼愈傷組織中單寧提取的影響由圖2（a）知，隨著乙醇濃度的升高，龍眼愈傷組織中單寧提取量先升高后降低。乙醇濃度在60%時，單寧提取量最高達(dá)到6.12mg•g-1，表明龍眼愈傷組織中單寧提取最佳乙醇濃度為60%。由圖2（b）知，隨著提取時間的延長，龍眼愈傷組織細(xì)胞單寧量也隨之增加，45min時提取量最高，為6.51mg•g-1，隨著時間進(jìn)一步延長，單寧提取量開始下降。說明在一定時間范圍內(nèi)，延長超聲波提取時間有利于單寧的提取，可能是因為超聲波作用使細(xì)胞破碎更充分，使單寧物質(zhì)易于提取；當(dāng)時間過長時，提取液溫度升高，單寧發(fā)生氧化，導(dǎo)致提取量減少。因此本研究篩選的單寧最佳提取時間為45min。超聲波可以破碎愈傷組織細(xì)胞，有利于單寧物質(zhì)從細(xì)胞中溶出。由圖2（c）知，隨著超聲波功率的增大，龍眼愈傷組織細(xì)胞單寧量也隨之增加，并在120W時提取量達(dá)到最高，為6.93mg•g-1，隨著功率的進(jìn)一步增大，單寧提取量逐漸降低。說明超聲波功率偏低時，對龍眼愈傷組織細(xì)胞的破碎作用不充分，單寧的溶出率有限；隨著超聲波功率的增大，“空化效應(yīng)”增強，改善了溶液中單寧的溶出效果，但當(dāng)超聲波功率過高時，放出的熱量，會加速溶液中單寧的氧化。因此，本研究確定的最佳超聲波功率為120W。

2.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果分析及條件優(yōu)化2.5.1超聲波輔助提取龍眼愈傷組織中單寧量的響應(yīng)面試驗利用超聲波輔助提取龍眼愈傷組織中單寧的方法，對提取條件中的乙醇濃度（A）、超聲波功率（B）及提取時間（C）與單寧提取量設(shè)計了17組響應(yīng)面實驗，測量每組實驗的單寧量（見表4），然后利用Design-Expert8.0.6軟件對表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項式回歸方程：Y=6.77-0.11A+1.14B+0.46C+0.056AB+0.34AC+0.80BC-0.89A2-0.63B2-1.14C2，R2=0.9798。由表5可知，該模型具有高度顯著性（p<0.0001），決定系數(shù)R2=0.9798，失擬項不顯著（p=0.550>0.05），表明該回歸模型擬合度好，實驗值與預(yù)測值比較接近，因此可以用此模型對超聲波提取龍眼愈傷組織細(xì)胞單寧的工藝參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測。方差分析結(jié)果中，B、C、A2、B2、C2對單寧的提取量有極顯著影響（p<0.0001），AC為顯著影響因素，A和AB影響不顯著。說明回歸方程具有較好的擬合度。因此，可用該模型代替真實試驗點對試驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。利用Design-Expert8.0.6軟件繪制能反映影響單寧提取量的3個因素交互作用的二維等高線圖和三維響應(yīng)面圖，如圖3（a）~（c）所示。響應(yīng)面坡度陡峭程度和等高線橢圓形狀反映了交互作用強弱趨勢。其中，坡度平緩表示兩因素交互作用不顯著，坡度陡峭表示兩因素交互作用顯著；圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著。從圖3（a）可以看出，乙醇濃度A與超聲波功率的交互作用對龍眼愈傷組織單寧提取量無影響，而乙醇濃度A和提取時間C（圖3（b））與超聲波功率B和提取時間C（圖3（c））的交互作用對龍眼愈傷組織單寧提取量有顯著影響。由圖3（b）知，固定超聲波功率B在0水平時，乙醇濃度A在60%、提取時間C在48min以內(nèi)對龍眼愈傷組織單寧提取量的影響呈顯著（p＜0.05）正相關(guān)交互關(guān)系；反之，當(dāng)乙醇濃度A高于60%、提取時間C大于48min時，二因素的交互作用對龍眼愈傷組織單寧提取量的影響具有顯著（p＜0.05）負(fù)相關(guān)交互關(guān)系。當(dāng)乙醇濃度較低時，隨著濃度的升高，由于“相似相溶”原理，可以提高單寧的提取量，此外，提取時間適當(dāng)延長也有利于龍眼愈傷組織中單寧物質(zhì)的溶出，當(dāng)二者在一定范圍內(nèi)同時增大時，由于協(xié)同作用龍眼愈傷組織單寧提取量增加更明顯；但當(dāng)乙醇濃度過高時，導(dǎo)致水解單寧組分不能完全溶出，對提取量造成影響，而提取時間過長會導(dǎo)致部分單寧氧化分解。因此，在一定范圍提高提取溫度，加大乙醇濃度有助于提高龍眼愈傷組織單寧的提取量，但當(dāng)乙醇濃度過高、提取時間過長時，反而會降低單寧的提取量。由圖3（c）知，當(dāng)乙醇濃度A固定在0水平時，超聲波功率B在140W、提取時間C在54min以內(nèi)時，二因素的交互作用與龍眼愈傷組織單寧提取量呈極顯著（p＜0.01）正相關(guān)交互關(guān)系；反之，當(dāng)超聲波功率B超過140W、提取時間C大于54min時，與龍眼愈傷組織單寧提取量呈極顯著（p＜0.01）負(fù)相關(guān)交互關(guān)系。當(dāng)超聲波功率較低時，隨著功率的增大，空化作用增強，分子的擴散速度增大，有利于提高單寧的提取量。此外，適當(dāng)延長提取時間也有利于龍眼愈傷組織中單寧物質(zhì)的溶出，當(dāng)二者在一定范圍內(nèi)同時增大時，由于協(xié)同作用使龍眼愈傷組織單寧提取量增加更明顯；但當(dāng)超聲波功率過高時，強烈的空化作用會導(dǎo)致單寧成分的分解，從而影響提取量，而長時間使用超聲波會導(dǎo)致溫度升高，單寧被氧化分解。因此，在一定范圍內(nèi)，增大超聲波功率、升高提取溫度有助于提高龍眼愈傷組織單寧的提取量，但當(dāng)超聲波功率過高、提取時間過長時又會降低單寧的提取量。2.5.2響應(yīng)面試驗的最佳優(yōu)化結(jié)果及驗證采用響應(yīng)面分析方法，對龍眼愈傷組織單寧的超聲波提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度60.78%、超聲波功率140W、提取時間53.44min，此時單寧量的理論值為7.62mg•g-1。但考慮到實際情況，將乙醇濃度調(diào)整為61%、超聲波功率為140W、提取時間為54min。在此修正條件下進(jìn)行龍眼愈傷組織中單寧的提取，重復(fù)3次，實際提取的單寧量為7.53mg•g-1，與理論預(yù)測值7.62mg•g-1的相對誤差為2.0%（見表6），與預(yù)測值無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05），說明與實際提取量相吻合，該回歸方程可靠，利用響應(yīng)面優(yōu)化法得到的龍眼愈傷組織細(xì)胞單寧提取條件真實有效。

3討論

利用超聲波輔助法能高效提取龍眼愈傷組織中的單寧。超聲波輔助提取法已廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取，該技術(shù)具有能耗低、效率高、用時短、成本低等優(yōu)點［6⁃10，15］，同時相對于傳統(tǒng)提取方法，超聲波輔助法可避免長時間加熱對生物活性物質(zhì)的破壞，具保質(zhì)作用［16］。根據(jù)“相似相溶”原理，單寧一般采用水或有機溶劑作為浸提液。由于單寧的組成成分比較復(fù)雜，使用單一溶劑無法完全浸提出單寧，且水的極性大，會浸提出較多雜質(zhì)影響后續(xù)分離提純，因此，很少單獨將水而是將含有機溶劑（如丙酮、乙醇、甲醇）的水溶液作為浸提液［5］。同時，乙醇較丙酮、甲醇等有機溶劑安全，已作為單寧提取溶劑應(yīng)用于桑葉等材料中［17］。因此，本研究選擇乙醇為提取溶劑，利用超聲波輔助法進(jìn)行龍眼愈傷組織中單寧成分的提取。響應(yīng)面分析法具有試驗次數(shù)相對較少、實驗精度較高的優(yōu)點［18］。在優(yōu)化得到的最佳工藝條件下測得的龍眼愈傷組織中單寧的量與理論值基本吻合，因而利用該方法得到的提取工藝具有實用價值，為龍眼愈傷組織細(xì)胞工廠化生產(chǎn)單寧提供了一定的科學(xué)依據(jù)。愈傷組織具有增殖快、周期短和不受季節(jié)限制等特點［19］。根據(jù)植物細(xì)胞全能性理論，利用愈傷組織可以生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物，例如多糖［11］。而龍眼愈傷組織中單寧提取及量的測定尚未見報道。采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取龍眼愈傷組織細(xì)胞單寧的工藝，經(jīng)驗證，該方法操作方便、提取量高、數(shù)據(jù)精確。

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作者：劉生財 段俊朋 姚德恒 林玉玲 賴鐘雄 單位：福建農(nóng)林大學(xué)