布魯氏菌的抗感染免疫機制范文

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《微生物學報》2016年第二期

摘要：

布魯氏菌病是由布魯氏菌引發的世界范圍的人獸共患傳染病。布魯氏菌為兼性胞內寄生菌，無典型的毒力因子，但卻有很強的致病性，常引發人和動物的慢性感染。逃逸宿主的抗感染免疫反應是慢性感染的先決條件，這種能力對于布魯氏菌的毒力來說似乎也越來越關鍵。作為成功的致病性病原菌，布魯氏菌采用“隱秘的”策略以逃避或抑制固有免疫、調節適應性免疫，從而在宿主細胞內建立長期的持續性感染。本文將圍繞布魯氏菌逃逸宿主的抗感染免疫的分子機制進行闡述，旨為闡明布魯氏菌毒力的新見解，這很可能為布病的預防開辟新的途徑。

關鍵詞：

布魯氏菌，固有免疫，適應性免疫，逃逸

抗感染免疫是指機體抵御病原體感染的能力，包括固有免疫和適應性免疫。機體在防御病原體感染過程中，抗感染免疫（免疫防御）發揮非常重要的作用。病原體一旦入侵機體，宿主通過抗感染免疫來監測、防御并清除入侵的病原體，而病原體為了能夠在宿主體內生存，在進化過程中也形成了多種有效的生存策略以逃避機體對自身的識別和清除、逃逸或拮抗宿主的免疫攻擊。不同的病原體逃逸機體的抗感染免疫機制不盡相同，但大體可歸納為三類即隱匿、誘變和抑制[1]。隱匿是指病原體通過感染免疫細胞本身或寄生于免疫應答不易到達之處而逃逸免疫攻擊；誘變是指病原體通過改變自身的抗原特性，從而逃逸業已誘生的免疫應答的作用；抑制是指病原體通過其結構和非結構產物，拮抗、阻斷和抑制機體的免疫應答。布魯氏菌是一種典型胞內寄生的、革蘭氏陰性小球桿菌。它雖然無典型的毒力因子（如外毒素、莢膜、菌毛、鞭毛），但卻有很強的致病性。其致病性的關鍵在于能夠適應環境的變化，維持自己在專職的吞噬細胞（包括巨噬細胞和樹突狀細胞）及胎盤滋養層細胞內長期存活[2-4]。布魯氏菌作為成功的致病性病原菌，采用“隱秘的”策略以逃避或抑制固有免疫、調節適應性免疫，從而建立慢性、持續性感染。慢性感染意味著病原體毒力和宿主抵抗力間處于平衡狀態[5]。盡管布魯氏菌被稱為“隱秘的”病原體，這并不意味著機體的免疫系統完全看不見它們。其實，免疫系統可以檢測到它們并誘發特異的免疫反應。在感染的初期或急性期，機體能否及時控制布魯氏菌的復制、成功消滅其感染，固有免疫系統是關鍵所在。但在感染的后期，建立有效的適應性免疫是十分必要的[6]。適應性免疫能夠幫助機體清除感染，建立具有記憶功能的特異性免疫。

1布魯氏菌逃避固有免疫

固有免疫又稱非特異性免疫，它是個體與生俱有的，是機體抵抗病原微生物感染的的第一道防線，包括多種效應細胞和分子，如噬中性粒細胞、巨噬細胞、補體、NK細胞等。機體能否及時控制、消滅病原體感染，固有免疫系統是關鍵所在。在布魯氏菌感染的初期，固有免疫系統能夠控制其復制，還能夠與適應性免疫相聯系，為宿主提供生成強烈的Th1免疫應答的環境。布魯氏菌作為成功的病原體，它采取“隱秘的”方式來對付固有免疫系統，從而避免被模式識別受體（patternrecognitionreceptors,PRRs）持續識別，同時也避免了引發強烈的炎癥反應[7,8]。PRRs包括細胞膜表面的Toll樣受體（TLRs）[9]、胞漿的Nod樣受體（NLRs）[10]和補體[11]。這些受體的功能類似于“條形碼”一樣，通過識別保守的病原體相關分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)的特征性組合，能夠識別病原體并幫助機體區分細菌、病毒和寄生蟲[12]。而機體主要通過補體和TLRs的激活引發典型的抗菌反應[13]。然而，在布魯氏菌感染期間，這些典型的抗菌反應卻無法看到。原因是布魯氏菌表面特殊的結構特征不能激活補體和TLRs，因而不能引發強烈的固有免疫反應。確實，布魯氏菌沒有明顯的毒力因子，它分子表面的脂多糖(LPS)、含鳥氨酸的脂質、脂蛋白、鞭毛等都是很弱的固有免疫誘導劑。這些結構缺乏標記的PAMPs活性，因此某種程度上可以逃避PRRs的識別[14]。如，布魯氏菌LPS的脂質A(LipidA)可以逃避TLR4的識別，因為LipidA含有更長的脂肪酸鏈(C28)，而典型的LPS脂肪酸鏈為(C12–C16)，這種修飾大大降低了TLR4誘發的炎癥反應[15]。除了逃避TLR4的識別，布魯氏菌通過生成鞭毛蛋白阻止TLR5的激活[16]。

因為鞭毛蛋白缺乏激活TLR5的結構域，因此無法激活TLR5介導的炎癥反應[17]。此外，布魯氏菌通過分泌效應蛋白Btp1/TcpB，誘導信號蛋白MAL的泛素化降解，從而抑制TLR2、TLR4的信號[18-21]。而且，布魯氏菌Btp1/TcpB還可以抑制DCs的成熟使其處于中間成熟期，從而抑制促炎因子TNF-α和IL-12的分泌[19,22]。另外，布魯氏菌LPS的O-抗原缺乏自由羥基，因此不能與補體C3結合，從而抑制促炎補體C3a和C5a的生成[7]。布魯氏菌由于缺乏標記的PAMPs活性成分，因此可以逃避固有免疫系統的識別，從而避免宿主細胞的全面活化。這將為布魯氏菌控制布氏小體(Brucella-containingvacuole,BCV)到達內質網(oplasmicreticulum,ER)處建立復制小室提供了一段時間。復制小室的形成有利于布魯氏菌抵制惡劣的環境，保護其免于體液免疫的殺傷以及吞噬細胞的吞噬作用[8,23]。研究表明：布魯氏菌在定居于宿主巨噬細胞的ER處之前，宿主完全有能力與其搏斗[24]。因此，可以說，宿主的巨噬細胞或樹突狀細胞(DCs)的ER是布魯氏菌安全的港灣，它需要利用一些生存機制才能到達以避免被免疫系統摧毀。另外，布魯氏菌在吞噬細胞內部可以控制感染細胞的生理活動，這也為其提供了顛覆免疫反應的機會。

2布魯氏菌調節適應性免疫

適應性免疫又稱獲得性免疫、特異性免疫，DCs是調節適應性免疫的中樞[25]。然而，布魯氏菌通過進化能夠干涉從固有免疫到適應性免疫的傳輸信號，從而顛覆DCs的功能以逃避宿主免疫系統的攻擊。研究表明：布魯氏菌可以在體外[19]或體內[3]的DCs內進行快速增殖。而且，B.abortus2308和B.suis1330能夠在體外阻礙DCs的表型成熟[19,22]。的確，布魯氏菌感染的DCs表現為II類主要組織相容性復合體（MHCII）、CD80和CD86共刺激分子表達量低，這抑制了DCs表型成熟。DCs的成熟決定抗原提呈和T淋巴細胞的激活。不成熟的DCs即表現為不分泌促炎性細胞因子TNF-α和IL-12、無效的抗原提呈給未致敏的T細胞。適應性免疫是為機體提供記憶的關鍵，也是疫苗接種持久性的必不可少的特性。細胞因子在免疫反應中扮演關鍵的角色，它不僅能夠調節天然和適應性免疫，還能夠指導免疫相關細胞的免疫反應。布病中最關鍵的細胞因子有IL-12、IFN-γ和TNF-α[8,26,27]。TNF-α能夠強烈地激活吞噬細胞的殺菌活性；IL-12可以引發Th1免疫反應從而生成IFN-γ；而IFN-γ-介導的I型免疫反應是清除布魯氏菌所必需的[28]，因此它也是布病中最關鍵的細胞因子[6,29,30]。

機體感染布魯氏菌后，主要通過三種適應性免疫反應抵御感染。①由CD4+,CD8+和γδT細胞生成IFN-γ，它能夠激活巨噬細胞的殺菌活性以阻止布魯氏菌在胞內的存活。②由CD8+和γδT細胞產生的細胞毒性，它可以殺死感染的巨噬細胞。③Th1型抗體亞型，如IgG2a和IgG3，可以調理布魯氏菌以促進吞噬溶酶體的吞噬降解。如，很多血清被動轉移試驗表明體液免疫對鼠源布病具有一定意義[28]。布病的一個顯著特征是布魯氏菌能夠在宿主細胞內長期存活。因此，它的最終目標就是在宿主體內建立慢性感染。研究表明，慢性感染布魯氏菌的宿主體內的免疫力被抑制。如，感染鼠脾臟內的CD4+和CD25+T細胞數量增加，它們能夠調節效應T淋巴細胞，有助于B.abortus的持續性感染[31]。而利用抗體封閉鼠的CD4+和CD25+T細胞，則可以清除靶器官的布魯氏菌[31]。另外，CD4+和MHCII類Aβ缺陷的缺失鼠比野生鼠更易于清除布魯氏菌感染[4]。免疫抑制將引起機體對感染的布魯氏菌（肝、脾和淋巴結處）清除不足[32]，由于CD8+T淋巴細胞的激活被抑制、巨噬細胞和DCs的募集逐漸降低[33]。而且，布魯氏菌通過減少IL-12的分泌、抑制感染的DCs刺激活化T細胞，以阻礙保護性Th1免疫反應[19]。

結果，布魯氏菌感染DCs后進入半成熟表型即細胞表面的MHCII類分子和共刺激分子均低表達，二者是DCs提呈外源性抗原給特異性T細胞所必需的[22]。布魯氏菌很可能通過阻止DCs的全面激活，利用DCs免疫耐受的特性以顛覆免疫反應。研究表明：遷移的DCs也能夠誘導免疫耐受[34]。布魯氏菌感染的DCs呈現半成熟表型很可能有助于誘導機體的免疫耐受以建立持續的慢性感染。人類的慢性布病患者表現為轉化生長因子-β（TGF-β）依賴的Th1免疫反應被抑制，由于不成熟的DCs與未致敏的CD4+T細胞相互作用誘導了T調節細胞的分化[35]。此外，鼠體內IL10水平的降低有助于宿主抵抗布魯氏菌感染[36]。這表明布魯氏菌通過阻礙抗原提呈以影響固有免疫和適應性免疫間的相互作用。TLRs在激活固有免疫反應、抵御微生物感染方面扮演很重要的角色。在感染期間，TLR2、TLR4和TLR9是很重要的感應細菌感染的受體。因此，布魯氏菌利用其分泌蛋白干擾感染的DCs的TLR依賴路徑，以阻礙DCs的成熟。三種布魯氏菌即B.abortus、B.melitensis和B.ovis編碼Toll/IL1receptor（TIR）domain-containingprotein(TcpB)蛋白[19,37]。TcpB也稱為Btp1，可以阻礙TLR2和TLR4介導的NF-κB的激活并抑制DCs的成熟[18,19]。TIR結構域含有的接頭蛋白(TIRdomain-containingadaptorprotein,TIRAP)可以募集信號接頭蛋白MyD88去激活TLR2和TLR4[38]。TcpB可以模擬TIRAP分子的特性從而有效地阻斷TIRAP誘導的TLR2和TLR4的激活[20]。而B.abortusBtp1突變株則能夠部分地促進DCs的成熟并增加TNF-α和IL-12的分泌[19]。最近的研究表明：TcpB/Btp1作為一個新的適應性免疫入侵的效應器，能夠抑制CD8+T細胞的殺傷作用。由于Btp1能夠與磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PI(4,5)P2)或PI(3,4,5)P3結合，這就抑制了免疫突觸的抗原提呈細胞的激活從而抑制CD8+T細胞的殺傷作用[26]。

本課題組前期利用抑制性差減雜交（SSH）技術，構建了綿羊響應布魯氏菌強毒株B.melitensis和疫苗株B.suisS2白細胞層差減cDNA文庫，篩選獲得了綿羊差異表達基因-程序性細胞死亡因子10(programmedcelldeath10，PDCD10)[39]。PDCD10又稱為CCM3，它是一個新的、高度保守的接頭蛋白。它含有兩個保守的功能結構域：N末端二聚體結構域和C末端focaladhesiontargeting(FAT)同源結構域，其中C末端FAT同源結構域與粘著斑激酶（focaladhesionkinases，FAK）的FAT結構域在空間結構上高度相似[40]。據報道，在人類免疫缺陷病毒(HIV)感染過程中，HIV病毒或其表面gp120糖蛋白能夠引發FAK的FAT結構域與CD4+分子的胞吞基序結合，從而誘導非感染的T細胞的凋亡，這將有利于病毒的融合和復制[41]。因此，我們推測布魯氏菌很可能像HIV一樣，利用其表面的某個膜蛋白或其分泌的效應蛋白，引發PDCD10分子與CD4+分子結合，從而逃避機體的免疫反應。新的免疫入侵效應器的發現能夠進一步解釋布魯氏菌逃逸適應性免疫反應的進化機制，而理解免疫逃逸的特異機制是設計有效的免疫保護性疫苗的前提條件。

3小結和展望

固有免疫系統利用PRRs精確地發現入侵的病原體后，機體被誘發有效的免疫反應（包括固有免疫和適應性免疫反應）抵御病原體感染。然而，很多成功的病原體已經進化了多重且有效的策略以逃避或顛覆宿主的防御機制，布魯氏菌就是其中成功的典范之一。它采取“隱秘的”方式入侵宿主細胞，避免被PRRs識別從而逃避免疫監測，但這并不意味著機體完全無法監測到它們。其實，機體仍然能夠監測到布魯氏菌并形成特異性的免疫反應。結果，典型的細胞殺菌活性不能被有效地激活，生成的免疫反應不足以清除布魯氏菌，相反卻引發肉芽腫樣的炎癥。最終導致布魯氏菌和宿主的抵抗力間長期處于平衡狀態，允許其在胞內長期存活。

目前，國內外研究學者所面臨的最大的挑戰就是布魯氏菌引發宿主的免疫抑制。一些研究表明，效應T細胞阻礙性激活以及巨噬細胞和DC激活的逐漸減少很可能是由于免疫抑制引起的[33]。這也可以解釋為什么靶器官的布魯氏菌清除不足。而且，布魯氏菌誘導DCs呈現半成熟表型很可能導致機體發生免疫耐受以維持慢性感染。那么，布魯氏菌是如何誘導DCs呈現半成熟表型而引發機體的免疫耐受？又是通過何種方式逃逸、調節甚至顛覆宿主的免疫反應？我們該如何解除宿主的免疫抑制？這些問題的闡明將有助于研發用于治療或預防布病的有效藥物及疫苗。

作者：權伍榮 楊詠潔 單位：延邊大學農學院