Bt抗蟲基因?qū)ψ魑锏挠绊懛段?/h1>
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bt殺蟲原理
1．1Cry晶體蛋白Bt毒蛋白在伴孢晶體內(nèi)是以內(nèi)毒素（Protoxin）的形式存在，具有高度的專一性，只能造成靶標(biāo)昆蟲死亡，而對(duì)非靶標(biāo)人、畜、哺乳動(dòng)物無害。內(nèi)毒素本身不具備活性，當(dāng)內(nèi)毒素被靶標(biāo)害蟲攝取后，在害蟲中腸的堿性環(huán)境下被蛋白酶消化為具有殺蟲活性的小片段的毒性肽。這種毒性肽可以穿過圍食膜后到達(dá)中腸上皮柱狀細(xì)胞，并能夠識(shí)別與結(jié)合刷狀緣膜上特異的高親和受體位點(diǎn)。毒性肽與受體結(jié)合后，在受體的幫助下毒性肽的部分結(jié)構(gòu)能夠插入細(xì)胞膜中，通過在細(xì)胞膜上形成非特異性孔道來破壞細(xì)胞離子平衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞的破裂。
1．2Vip蛋白Vip3的殺蟲機(jī)理主要體現(xiàn)在對(duì)害蟲中腸細(xì)胞的破壞上。Yu的組織病理學(xué)觀察試驗(yàn)是研究Vip3A作用機(jī)制的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)：用Vip3A蛋白去飼喂敏感昆蟲，72h后，中腸上皮細(xì)胞和基底膜脫落，昆蟲死亡［4］。VIP3為可溶性蛋白，不需通過昆蟲中腸的消化即可直接起作用，通過誘發(fā)中腸細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致昆蟲死亡。
2Bt基因在作物中的應(yīng)用
1987年，Montagu實(shí)驗(yàn)室的Veack等人將Bt基因轉(zhuǎn)入到煙草中，獲得了抗煙草天蛾的轉(zhuǎn)基因煙草植株。這是首次實(shí)現(xiàn)抗蟲基因應(yīng)用于植物的報(bào)道。隨后幾年科學(xué)家在對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因植株的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然轉(zhuǎn)基因植株存在一定的抗蟲性，但蛋白的表達(dá)量?jī)H占可溶性蛋白的0．001％。科學(xué)家進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其主要原因是由于：①野生型Bt基因的mRNA在植物中半衰期短，表達(dá)不穩(wěn)定；②Bt基因是微生物基因，在轉(zhuǎn)譯時(shí)某些tRNA含量過少，翻譯效率低下。盡管早期Bt轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲效果不理想，但是通過不理想原因的分析和發(fā)現(xiàn)，為后來高效表達(dá)Bt毒蛋白轉(zhuǎn)基因植物的研究奠定了基礎(chǔ)。自此伊始，人們?cè)贐t毒蛋白基因的修飾和改造、表達(dá)載體的構(gòu)建、植物組織轉(zhuǎn)化、抗蟲植物的培育等方面進(jìn)行了大量的研究。初期，科學(xué)家對(duì)ICPs研究較多，并延續(xù)至今。1992年，中國(guó)農(nóng)科院郭三堆等人通過雙鏈合成DNA的方法，在我國(guó)首次合成了CryIA基因；并將Bt基因?qū)朊藁ǎ@得高抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉花，使中國(guó)成為繼美國(guó)之后，第2個(gè)獲得擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的國(guó)家。此外，有研究機(jī)構(gòu)也合成及部分改造了CryIA基因并成功導(dǎo)入煙草，甘藍(lán)和大豆［5］。2004年，林擁軍等人工合成cry1C＊和cry2A［6］。該研究將基因內(nèi)部的密碼子置換成植物偏愛性密碼子，并在編碼序列的5＇端和3＇端分別添加了引導(dǎo)序列和加尾識(shí)別信號(hào)序列，使之更易于在植物中表達(dá)。2009年，Sujatha將cry1Ec導(dǎo)入蓖麻（RicinuscommunisL．）中，結(jié)果對(duì)斜紋夜蛾（SpodopteralituraFabr）和蓖麻夜蛾（AchoeajanataL．）都表現(xiàn)出殺蟲活性［7］。2011年，Ta－bashnik等研制出新Bt毒素（Cry1AbMod和Cry1AcMod），對(duì)5種產(chǎn)生抗性的害蟲，如小菜蛾（P．xylostella）、棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）、歐洲玉米螟（Ostrinianubilalis）等都具有殺蟲活性［8］。而后，對(duì)新型殺蟲蛋白VIPs的研究應(yīng)用也日益增多。2003年，先正達(dá)公司研制成功表達(dá)VIP3A毒蛋白的棉花品種COT102；2007年，又將COT102與轉(zhuǎn)cry1Ab基因棉花COT67B雜交選育而成VipCotTM棉花［9］，是首個(gè)含有VIPs和Cry蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花。同年，又培育出轉(zhuǎn)vip3Aa20的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162。近年來，Bt轉(zhuǎn)基因作物中的研究呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)化的基因由單一基因向多基因發(fā)展；由單純Bt基因轉(zhuǎn)化向Bt基因與其他抗蟲基因（蛋白酶抑制劑基因、凝集素基因和2－淀粉酶抑制劑基因等）協(xié)同轉(zhuǎn)化發(fā)展；表現(xiàn)的性狀由單一性狀向復(fù)合性狀發(fā)展；轉(zhuǎn)化的品種從糧食作物如水稻、玉米、大豆、土豆、小麥等；到經(jīng)濟(jì)作物如棉花、楊樹、甘蔗等；從蔬菜作物如油菜、甜菜等，到藥用或嗜好作以及盆栽植物如苧麻、菊花、石斛蘭等等。截至目前，我國(guó)并未商業(yè)化生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因主糧。
3轉(zhuǎn)Bt基因作物存在的問題
3．1抗藥性轉(zhuǎn)Bt基因作物在對(duì)蟲害防治方面以及對(duì)減少化學(xué)品危害方面確實(shí)做出了巨大的貢獻(xiàn)。但轉(zhuǎn)基因作物仍然面臨了化學(xué)農(nóng)藥相似的弊端—抗藥性，這或許是橫亙?cè)摷夹g(shù)前進(jìn)的最大障礙。目前，已有至少20多種昆蟲在自然選擇或者室內(nèi)和溫室中通過人工選擇產(chǎn)生了對(duì)Bt作物的抗性，如美洲棉鈴蟲、非洲鉆心蟲、草地夜蛾、棉鈴蟲、棉紅鈴蟲、煙芽夜蛾、小菜蛾等。科學(xué)家主要從生理生化、行為和分子遺傳等方面對(duì)昆蟲的抗性機(jī)理進(jìn)行了研究。
3．1．1生理生化方面棉貪夜蛾的腸蛋白酶活性隨著蟲齡而增加，4齡幼蟲比1齡和2齡幼蟲的可以降解更多的毒蛋白。昆蟲中腸上皮細(xì)胞受體與活性毒素的結(jié)合是殺蟲的重要機(jī)理之一。目前，Bt蛋白受體主要分為鈣粘蛋白、氨肽酶、堿性磷酸酶和一種糖脂類物質(zhì)等四類物資。煙芽夜蛾中腸上的堿性磷酸酶是Cry1Ac毒素蛋白結(jié)合受體，與非抗性昆蟲相比，抗性昆蟲的磷酸酯酶活性減少一半［25－26］。
3．1．2昆蟲行為方面昆蟲對(duì)含Bt的食物的會(huì)有一種類似出于本能的躲避危害的行為。昆蟲會(huì)在取食含Bt的食物后，有一個(gè)快速的停食反應(yīng)，或者迅速轉(zhuǎn)移取食位置，從而減少毒素?cái)z入量，或躲開最高Bt劑量，這也是抗性產(chǎn)生的一種方式。
3．1．3分子遺傳方面目前研究發(fā)現(xiàn)，與昆蟲產(chǎn)生抗性有關(guān)的基因是隱性基因或不完全顯性的，基因突變是昆蟲抗性產(chǎn)生的重要原因之一。Morins研究發(fā)現(xiàn)，棉紅鈴蟲抗性品系的三種鈣黏蛋白基因發(fā)生突變，相關(guān)位點(diǎn)堿基缺失，導(dǎo)致Cry受體結(jié)合部位氨基酸序列的缺失；Avisar研究發(fā)現(xiàn)抗性的甘藍(lán)銀紋夜蛾對(duì)Cry1A的最大結(jié)合率變小，受體蛋白基因中的結(jié)合區(qū)域也變得更短。針對(duì)昆蟲產(chǎn)生抗性的問題，科學(xué)家也進(jìn)行了延緩或者阻止其產(chǎn)生抗性的研究，主要采取以下幾種方式。（1）提高Bt劑量：利用現(xiàn)代生物技術(shù)提高Bt的表達(dá)水平，增強(qiáng)作物的抗性。（2）使Bt蛋白特異表達(dá)：主要是使作物在受到昆蟲傷害時(shí)或者特殊時(shí)期才表達(dá)Bt蛋白。（3）庇護(hù)所：通過在Bt作物附近種植一些非Bt的正常植物，來保證一定數(shù)量的非抗性蟲體，通過非抗性蟲體和抗性蟲體的交配，從而稀釋抗性基因。（4）高劑量和庇護(hù)所聯(lián)合使用：就是在提高Bt作物表達(dá)水平的同時(shí)，再在附近種植一些非Bt的正常植物，效果較好。（5）多種基因復(fù)合：通過將兩種及以上的基因復(fù)合到同一作物中，使之對(duì)昆蟲產(chǎn)生復(fù)合抗性。
3．2基因漂移轉(zhuǎn)Bt基因植物也和其他轉(zhuǎn)基因植物一樣出現(xiàn)向常規(guī)栽培種及野生近緣種中飄移的現(xiàn)象。已有研究發(fā)現(xiàn)，Bt基因在玉米、棉花上可以通過花粉向近緣非轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)移；通過轉(zhuǎn)基因大豆可以向人類腸道微生物轉(zhuǎn)移。Netherwood等把轉(zhuǎn)基因大豆（EPSPS）的漢堡和豆奶昔給7個(gè)腸道造口的和12個(gè)健康的志愿者食用。結(jié)果，7個(gè)腸道造口志愿者的小腸中都出現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因，其中3個(gè)還出現(xiàn)了向腸道微生物轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象；但在12個(gè)健康個(gè)體的糞便中沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因，說明轉(zhuǎn)基因能在人的大腸中降解。這可能引起食用者胃腸功能的改變或有害人的健康［5］。
3．3對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響Bt基因作物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響主要是由于根系可以向土壤中分泌毒蛋白，并且需要一定的周期進(jìn)行降解。土壤中的毒蛋白可能會(huì)對(duì)越冬的昆蟲、敏感的昆蟲以及土壤的微生物等產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響整個(gè)土壤生態(tài)系統(tǒng)［5］。
3．4在食品安全方面商業(yè)種植的轉(zhuǎn)Bt基因作物，主要是對(duì)目標(biāo)害蟲進(jìn)行專一性傷害，但對(duì)人和其它動(dòng)植物無害。張珍譽(yù)［30］開展了轉(zhuǎn)Bt基因稻谷對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)和器官發(fā)育、小鼠胚胎生長(zhǎng)發(fā)育、致敏性生物信息學(xué)、小腸mtDNA突變以及體內(nèi)殘留的研究。結(jié)果：以轉(zhuǎn)Bt基因飼喂的小鼠沒有出現(xiàn)任何不適癥狀，并且各項(xiàng)血清生化指標(biāo)及器官發(fā)育也都正常。同時(shí)，也未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和殘留。所以，試驗(yàn)說明將轉(zhuǎn)Bt基因稻谷作為小鼠的飼料基本是安全的。杜紅方［31］以轉(zhuǎn)基因水稻作為肉仔雞日糧原料進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)，研究發(fā)現(xiàn)以轉(zhuǎn)基因糙米作為肉仔雞飼料原料配制日糧，飼喂肉仔雞后未產(chǎn)生不安全作用，且未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分在肉仔雞體內(nèi)會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移和殘留。但對(duì)長(zhǎng)期安全性未做說明。雖然目前的研究沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物有毒性或者說營(yíng)養(yǎng)上的毒性，但是仍需要科學(xué)家通過長(zhǎng)期試驗(yàn)和更細(xì)致的研究來確保轉(zhuǎn)基因作物的安全性。目前，人們對(duì)食用轉(zhuǎn)Bt基因作物的安全十分關(guān)注，并形成了支持和反對(duì)的兩大陣營(yíng)。支持者多為具有學(xué)術(shù)頭銜的科學(xué)家，但其背后的商業(yè)利益背景備受指責(zé)。反對(duì)者大多來自民眾、或非專業(yè)人士，他們的擔(dān)心的理由往往并不充分，例如崔永元自費(fèi)赴美拍攝的紀(jì)錄片，并沒有給出一個(gè)令人信服的結(jié)論。被譽(yù)為水稻之父的袁隆平也稱轉(zhuǎn)基因食品不能一概而論。對(duì)于抗病抗蟲的轉(zhuǎn)基因食品，要特別小心謹(jǐn)慎，多做實(shí)驗(yàn)。美國(guó)在研究并應(yīng)用轉(zhuǎn)基因作物上持開放的態(tài)度，這可能與其經(jīng)濟(jì)利益有關(guān)，而歐洲保持了其一貫抗拒的態(tài)度。在我國(guó)，對(duì)于轉(zhuǎn)基因食品官方一方面保持了謹(jǐn)小慎微的態(tài)度，先后批準(zhǔn)了甜椒、番茄以及番木瓜3種作物作為商業(yè)化生產(chǎn)。但與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因作物優(yōu)勢(shì)的性價(jià)比是行業(yè)內(nèi)無法回避的事實(shí)，造成了我國(guó)每年大量進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)入食品加工領(lǐng)域，官方更像是處于決策的搖擺期間。目前我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性研究仍然是局部、短期的，對(duì)人類安全的評(píng)估缺少長(zhǎng)期、穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，建議招募志愿者進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)。
4小結(jié)
綜上所述，Bt抗蟲作物在生物農(nóng)藥的研究中已取得了巨大的進(jìn)展。通過將Bt基因轉(zhuǎn)入作物體內(nèi)表達(dá)，殺蟲活性可以一直存在于植物整個(gè)生命周期。相比農(nóng)藥而言，具有作用時(shí)間長(zhǎng)，不會(huì)被雨水等自然環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，又具有對(duì)人、畜和環(huán)境友好的特點(diǎn)，具有很好的發(fā)展前景。未來在觀賞植物、經(jīng)濟(jì)作物上具有更加廣泛的應(yīng)用空間。面對(duì)抗蟲性問題，多種抗蟲基因的混合利用對(duì)提高植物的抗蟲能力及抗蟲范圍具有較好的作用。安全性方面，對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因作物生物安全性的爭(zhēng)論仍然缺少長(zhǎng)期且更廣泛的實(shí)驗(yàn)支持以及更深入細(xì)致的研究。另外，轉(zhuǎn)基因作物存在基因漂移和對(duì)生態(tài)系統(tǒng)等的影響等問題也需要進(jìn)行長(zhǎng)期研究。轉(zhuǎn)基因這種人類對(duì)自然進(jìn)化的干預(yù)方式，為人類帶來利益以的同時(shí)可能也帶來的危害，人類必需在兩者之間尋求可以接受的平衡。途徑是通過更廣泛深入的研究，開發(fā)出安全性更好、性能更優(yōu)越的產(chǎn)物。
作者：吳新包夢(mèng)醒單位：蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局蘇州世標(biāo)檢測(cè)技術(shù)有限公司蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所