氣候條件對煙草葉片蛋白質的差異范文

本站小編為你精心準備了氣候條件對煙草葉片蛋白質的差異參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《河南農業大學學報》2016年第一期

摘要:

對同一煙草品種畢納1號在貴州畢節、河南寶豐兩種氣候條件下的葉片蛋白質表達差異進行了分析，篩選出6個響應氣候變化的差異表達蛋白質。3個蛋白質在畢節樣品中高表達，分別為為甘油醛三磷酸脫氫酶、O－乙酰絲氨酸硫解酶和光合系統Ⅱ23kD放氧復合蛋白質。這些蛋白質與煙草葉片能量合成、半胱氨酸合成以及光合系統的放氧活性有關。在寶豐樣品中高表達的3個蛋白質為質體脂質相關蛋白質、乙醇脫氫酶和液泡ATP酶G亞基，這3個蛋白質均為環境脅迫表達蛋白質，參與植物對外界脅迫環境的應答反應。這說明河南煙區的氣候特點對煙草的生長造成了一定的環境脅迫，從而誘導多個脅迫響應蛋白質大量表達，而貴州煙區的氣候特點則使得煙草的生長傾向于合成代謝的增強，如能量合成、氨基酸合成以及光合作用的進行。

關鍵詞:

煙草;氣候;蛋白質組

生態條件對植物的影響是巨大的，同一品種在不同生態條件下會有不同的表型和生理反應。煙草是一種生態適應性較廣泛的作物，在北緯60°與南緯40°間都有種植，且生長具有地域特點。煙葉的產量和質量受生態影響較大，相同的品種在不同的生態環境下的生長狀況各異，因此，根據當地特點選育的煙草品種能夠更好地適應當地氣候條件，具有較好的煙葉品質［1－2］。貴州畢節屬北亞熱帶季風濕潤氣候，夏無酷暑，冬無嚴寒，季風氣候比較明顯，降雨量較為充沛、河南寶豐屬暖溫帶，為半濕潤大陸性季風氣候，四季分明，以春旱多風、夏熱多雨、秋溫氣爽、冬寒少雪為特征［3－4］。2個地區都是主要的煙葉產區，都能夠生產出優質的煙葉，但其內在品質有很大差別，風格截然不同。氣候對植物生長的影響是通過影響植物的基因表達繼而影響內在代謝水平，最終表現出對于不同氣候的不同生長特性。蛋白質能體現生命有機體的生理代謝、信號轉導等功能，蛋白質組是一個生命有機體所有蛋白質序列和蛋白質空間結構的總和，生命的特征是通過蛋白質及蛋白質之間的相互作用體現出來的。蛋白質組學是以基因組編碼的所有蛋白質為研究對象，在生物個體不同的發育時期及不同的組織、器官等水平研究蛋白質的表達、結構、修飾等，在蛋白質的水平上探索蛋白質的表達及調控機制。其理論和方法已滲透到植物遺傳學、植物生理學、植物發育生物學等諸多學科研究領域，在農業相關的生物科學領域得到了廣泛的應用［5－6］。不同條件下的蛋白質組表達是有差異的，這造成了不同條件下各個生理活動的千差萬別。那么，在蛋白質組水平探究植物對氣候的響應是研究基因環境互作機制的現代化手段之一。畢納1號是畢節煙區自育的品性優良烤煙品種，尤其適應畢節地區的氣候特征。因此，為了研究烤煙對不同氣候響應的分子機制以及貴州、河南兩地的氣候條件下烤煙的代謝差異的分子基礎，本研究應用蛋白質組學研究手段對同一烤煙品種在兩地氣候條件下的蛋白質組表達差異進行了研究，篩選出響應氣候變化的顯著差異表達蛋白質，并進行相關分析，旨在為闡明植物對氣候的響應途徑及分子變化提供理論基礎。

1材料與方法

1．1品種及試驗設置煙草品種為畢納1號，試驗地設置在貴州畢節與河南寶豐。試驗為盆栽試驗，整個煙株生長期以營養液澆灌培養，每3～5d給予1次新鮮營養液。

1．2蛋白質樣品的制備將樣品用液氮研磨至粉末，TCA/丙酮溶液(1∶9)沉淀過夜，離心10000r•min－1，45min，去除上清液，加入丙酮溶液，離心10000r•min－1，45min，4℃去除上清液，重復2次。空氣干燥。按10∶1加入蛋白裂解液，裂解液成分包括8mol•L－1尿素，2mol•L－1硫脲，4%CHAPS，2%IPG緩沖液(pH3～10)和30mmol•L－1二硫蘇糖醇(DTT)。冰浴超聲破碎(80W，超聲10s，間歇15s，共10次)，離心10000r•min－1，30min，4℃。上清液用0．22μm濾管過濾，并使用Bio-Radproteinassayreagent定量，－80℃低溫保存。

1．3雙向電泳及圖譜分析雙向電泳等電聚焦步驟按照IPGphor等電聚焦系統(AmershamBiosciences)說明書進行。將100μg的蛋白質樣品溶于500μL的上樣緩沖液上樣于24cm的電解質膠條中(pH3～10，Non-Liner，AmershamBiosciences)，等電聚焦的程序設置為:30V12h，500V1h，1000V1h，8000V8h，500V4h。結束后將IEF膠條放入平衡緩沖液(6mol•L－1Urea，30%Glycerol，2%SDS，0．05mol•L－1TrispH8．8，1%DTT)中孵育15min，再將膠條轉入另一平衡緩沖液中(6mol•L－1Urea，30%Glycerol，2%SDS，0．05mol•L－1TrispH8．8，2．5%碘乙酰胺)中，孵育15min后。平衡結束將膠條轉移至15%聚丙烯酰胺SDS分離膠上，進行蛋白質的分離，于15℃進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(EttanDALTsixelectrophoresisunit，AmershamBiosci-ences)。電泳結束以銀染法對凝膠進行快速銀染色，采用高清晰度圖像掃描儀(PowerLook2100xl－USB，UMAX)掃描凝膠，每個樣品做3次重復。蛋白質表達圖譜用ImageMaster2DPlatinum6．5(GEHealthcare)軟件進行分析。蛋白質表達比值Ratio(打頂后/打頂前)大于1．50或小于－1．50的蛋白質點作為差異點。

1．4膠內酶解及Ziptip脫鹽將膠粒切碎后轉入EP管中，加入200～400μL100mmol•L－1NH4HCO3/30%ACN脫色液(銀染:加入30～50μL30mmol•L－1K3Fe(CN)6∶100mmol•L－1Na2S2O3=1∶1脫色液)，清洗脫色至透明，吸棄上清液，加入100mmol•L－1NH4HCO3，室溫孵育15min。吸棄上清液凍干，之后加入5μL2．5～10mg•L－1測序級Trypsin(Promega)溶液(酶與被分析蛋白質質量比一般為1∶20～1∶100)，37℃反應過夜，20h左右;吸出酶解液，轉移至新EP管中，原管加入100μL60%ACN和0．1%TFA，超聲15min，合并酶解液凍干;若有較多鹽分，則用Ziptip(millipore)進行脫鹽。

1．5質譜分析凍干后的酶解樣品，取2μL20%乙腈復溶。取1μL溶解樣品，直接點于樣品靶上，讓溶劑自然干燥后，再取0．5μL過飽和CHCA基質溶液(溶劑為50%ACN0．1%TFA)點至對應靶位上并自然干燥。樣品靶經氮氣吹凈后放入儀器進靶槽并用串聯飛行時間質譜儀(4800PlusMALDITOF/TOFTMAnalyzer)進行測試分析，激光源為355nm波長的Nd:YAG激光器，加速電壓為2kV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據，一級質譜(MS)掃描范圍為800～4000Da，選擇信噪比大于50的母離子進行二級質譜(MS/MS)分析，每個樣品點上選擇8個母離子，二級質譜(MS/MS)累計疊加2500次，碰撞能量2kV，CID關閉。

1．6數據庫查詢使用4800MALDI-TOF/TOF蛋白質組學分析器分析(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)，運用GPSExplorerTMsoftwareVersion3．6(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)在MASCOT搜索引擎(Version2．2;MatrixScience，London，UK)中進行蛋白質和肽段鑒定。查詢參數如下:NCBInr數據庫，煙草屬(2013，11，27)，胰蛋白酶消化，MS(一級質譜)和MS/MS(二級質譜)最大容許誤差范圍為100×10－6，肽片段相對分子質量最大容許誤差范圍為±0．4。選取質譜查詢中蛋白質及離子置信區間均大于99%為鑒定信息。

2結果與分析

2．1寶豐與畢節氣候條件下烤煙葉片蛋白質表達圖譜通過對兩地烤煙葉片蛋白質雙向電泳分離，取得蛋白質表達圖譜如圖1所示。經軟件分析共得明顯差異表達的蛋白質點12個，編號如圖1中阿拉伯數字所示。編號為561，551，795，791，1320，1334，1377與1184的8個蛋白質點在畢節氣候下的樣品中高表達(寶豐/畢節比值小于－1．50)，編號為880，570，1421與1551的4個蛋白質在河南氣候下的葉片中高表達(寶豐/畢節比值大于1．50)。

2．2寶豐與畢節氣候條件下烤煙葉片差異蛋白質的鑒定對所得的差異表達蛋白質進行質譜和信息學分析，除去冗余蛋白質，根據蛋白質鑒定的標準，篩選出6個差異表達蛋白質，功能信息如表1所示。其中795與791，561與551經鑒定分別為同一蛋白質，且各項鑒定得分均較高，可能為同一蛋白質的不同電荷形式。3個在畢節樣品中高表達的蛋白質為甘油醛三磷酸脫氫酶(561)、O－乙酰絲氨酸硫解酶(791)和光合系統Ⅱ23kD放氧復合蛋白質(1184)。3個在寶豐樣品中高表達的樣品為質體脂質相關蛋白質(880)、乙醇脫氫酶(570)和液泡ATP酶G亞基(1551)。

3結論與討論

以畢納1號為材料，選取氣候差異明顯的貴州畢節和河南寶豐進行試驗，且整個生長季以營養液進行培養，消除了烤煙生長的土壤差異因素，可以準確地反映出同一烤煙品種在截然不同的兩種氣候條件下生長的葉片蛋白質表達的差異。通過蛋白質表達譜表達分析，鑒定出差異蛋白質12個，經信息學分析，明確有生物信息學信息的蛋白質為6個。對蛋白質表達譜的分析表明，植物在不同的氣候條件下有不同的生理反應，但僅個別的蛋白質會發生變化即對氣候做出響應，而絕大多數的蛋白質并不會有明顯的表達差異。這也說明植物對環境的適應過程是某些關鍵的因子在起作用，而不是整個生理過程發生巨大的變化。本試驗鑒定所得的3個在畢節樣品中高表達的蛋白質為甘油醛三磷酸脫氫酶、O－乙酰絲氨酸硫解酶和光合系統Ⅱ23kD放氧復合蛋白質，尤其是甘油醛三磷酸脫氫酶與O－乙酰絲氨酸硫解酶在畢節葉片中表達量分別是寶豐樣品中的2．64與2．63倍，遠遠高于差異蛋白質篩選的1．5倍的標準。另外，3個在寶豐樣品中高表達的蛋白質為質體脂質相關蛋白質、乙醇脫氫酶和液泡ATP酶G亞基，表達量差異也都在2倍上下，表明這些蛋白質的表達具有顯著的差異性。

從功能上分析，甘油醛三磷酸脫氫酶是糖酵解途徑中的關鍵酶，ATP的生成即在該酶的控制下進行，控制著能量合成的多少;O－乙酰絲氨酸硫解酶催化半胱氨酸合成的最后一步，與半胱氨酸的含量密切相關;光合系統Ⅱ23kD放氧復合蛋白質是光合系統Ⅱ外周蛋白質中的1個，對光系統Ⅱ放氧活力的維持起重要作用［7－9］。這3個蛋白質在貴州葉片樣品中高表達，代表其參與的相應的代謝活動旺盛，提示在貴州氣候下生長的煙草葉片糖酵解代謝生產能量高，半胱氨酸合成旺盛以及光合系統Ⅱ的放氧活性較高。有文獻報道，不同的氣候條件對煙草葉片蛋白質表達影響最大的就是煙葉糖代謝途徑、呼吸代謝、光合途徑等相關的酶類［10－11］，這與本研究有相同之處。與之相比，在寶豐煙葉樣品中，質體脂質相關蛋白質、乙醇脫氫酶和液泡ATP酶G亞基3個蛋白表達量都高于畢節樣品中的表達量，且3個蛋白質均為脅迫誘導蛋白質，質體相關蛋白質也稱作原纖維蛋白質，脅迫條件下在茄科植物葉片中會大量積累。液泡ATP酶主要在鹽漬、干旱條件下受到誘導且起重要作用，而乙醇脫氫酶更是在各種非生物脅迫條件下如鹽、澇、干旱、低溫下被誘導表達，主要參與脅迫條件下乙醇酵解途徑，通過本身的高表達從而維持乙醇酵解途徑的高效進行，以增強植物的抗脅迫能力［12－14］。

有研究表明，植物在溫度超過適宜生長溫度10～15℃時，即產生熱脅迫反應［15］，煙草是溫度適應性較強的一種作物，具有較強的地域適宜性，因而種植范圍也較廣泛，在不同的生態環境中生長的煙草必然具有其內在的適應機制。本研究結果表明，煙草在畢節和寶豐的氣候、生態差別較大的環境生長下葉片的蛋白質表達差異較大，煙草生長季寶豐光照充足、雨熱同步的氣候特點對煙草的生長造成了一定的環境脅迫，從而誘導多個脅迫響應蛋白質大量表達。而畢節煙草生長季光照適中、溫濕均衡的氣候特點則使得煙草的生長傾向于合成代謝的增強，如能量合成、氨基酸合成以及光合作用的進行。研究結果也說明，不同的氣候條件會改變植物體內起主導作用的代謝途徑。比如畢節的氣候有利于植株的能量及物質的合成代謝，而寶豐的氣候則有利于植株的抗性生理代謝。

作者：楊惠娟 王景 黃化剛 史宏志 單位：河南農業大學煙草學院 貴州省煙草公司畢節市公司