淺析濕地微生物多樣性的研究范文

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摘要：描述了現在濕地微生物活性的研究狀況、環境因子對微生物群落多樣性產生的影響、濕地環境下功能性微生物的探究情況。重點就目前應用比較多的測定微生物多樣性的研究方法如傳統培養法、磷脂脂肪酸法、高通量測序技術等作出細致描述并針對各種研究方法的優勢及劣勢進行了比對分析。根據當前微生物數量和多樣性的檢查方式，在以后的分析過程中引進更優良的技術同時找到新的研究方法，以此來發現微生物種群很多未知的領域。

關鍵詞：濕地；微生物多樣性；分子生物學；環境因子

濕地兼具水生生態系統和陸地生態系統的特性，能調節局部區域氣候和維持群落微生物多樣性[1]。微生物多樣性包括微生物遺傳的多樣性，還包含了群落組成的變異、營養需求和供給水平、互相影響的復雜性以及共位群帶來的生物復雜性[2]。濕地微生物的研究有助于人們了解濕地微生物與其他因子間是否存在協同作用，從而構建更高效穩定的濕地系統。

1濕地微生物群落的研究方法

1.1傳統培養法培養法一般采用的培養基內所含的營養物質不同，針對能夠在培養基環境下生長的微生物進行研究。這種方式主要針對具有一種作用的微生物或某種病原菌的研究。但培養法的局限在于無法探明微生物的整體群落結構，且目前技術可培養微生物種類尚且不足微生物總體的百分之一。

1.2微生物群落生理代謝的研究方法1.2.1磷脂脂肪酸技術磷脂幾乎是所有具有活性細胞細胞膜的組成要素，一般伴著細胞凋亡逐漸脫落分解[3]。磷脂脂肪酸技術利用有機溶劑將活體微生物中的磷脂脂肪酸浸提出來經分離純化后，對磷脂脂肪酸圖譜進行解析從而了解微生物群落結構以及生物量[4]。在2001年，DuongruitaiNicomrat借助PLFA分析在廢棄礦山中濕地微生物的種類，結果顯示真菌和細菌是濕地系統中的主要種類，古細菌所占的相對豐度尚未到總微生物整體的0.01%[5]。該技術適用于批量分析，能夠反映出濕地污染狀況的改變。但目前還無法通過PLFA技術對微生物類群精準鑒定到種，并且土壤中有植物殘體存在，其中的磷脂脂肪酸會產生干擾。因此將PLFA技術與分子生物學技術結合，會對濕地微生物群落的多樣性有更加全面的認識。1.2.2BIOLOG碳素利用法BIOLOG碳素利用法是基于不同微生物利用碳源能力的區別以及代謝差異。該方法具有靈敏度高分辨力強等優點，能夠盡可能保證微生物可以通過以往的代謝方式進行生產，這種形式通常適用于評估土壤環境功能及微生物的群落結構。但是該方法使用中也存在著底物是否氧化完全等問題

1.3分子生物學方法1.3.1熒光原位雜交技術（FISH）FISH方法主要借助寡核苷酸探針再結合核酸，通過特殊的熒光顯微鏡發現所要尋找的DNA或RNA分子[6]。FISH方法現在主要是在特定環境條件下辨別微生物類群和定量檢查種群密度，描述水平細致的條件符合當前要求。熒光原位雜交技術的優勢在于不需要選擇核酸，還能確保微生物細胞結構和狀態能保證基本完整[7]。但該技術易受探針長度、雜交溫度和時間等因素的影響。1.3.2變性梯度凝膠電泳(DGGE)DGGE的原理是當達到DNA雙螺旋分離所需溫度的最小值時，雙鏈DNA會出現分解現象，最后形成的單鏈DNA無法在凝膠中順暢運行，同時螺旋位置分離是根據雙鏈基因的堿基序列進行執行的。因此觀察DGGE指紋圖譜的條帶數目可以發現各種樣品細菌群落所具有的相同一面。然而在進行PCR產物電泳時會導致共性遷移現象出現，對結果的準確性有一定的影響[8]。在2003年，Ibekwe通過PCR-DGGE技術針對氨單加氧酶基因(amoA)擴增條以及16SrRNA基因和帶都分別進行研究，分析濕地環境下細菌種群的總數目以及氨氧化后的細菌種群出現了哪些改變[9]。1.3.3熒光定量PCR多聚酶鏈式反應簡稱PCR技術，是上世紀發展起來的一種體外擴增特異性DN段的技術。Ochsenreite等研究了18處陸地環境中泉古菌的多樣性和豐度，利用qPCR確定了泉古菌在沙地根際和土壤中的相對豐度[10]。qPCR精確性高、特異性強且后期操作簡單，同時可從基因水平對微生物功能基因定量分析，特別是對氮循環相關功能菌群定量分析[11]。其優點在于可以在一個反應中進行一個以上基因的定量檢測。但其反應成本過高，實驗設計較為復雜。1.3.4高通量測序技術由于近些年來很多學者利用變性梯度凝膠電泳和熒光定量PCR等技術分析濕地微生物種類，然而該形式對微生物品種無法實現定性和定量研究同時進行。HelicoBioScience企業2008在Science雜志發表了其研發的在全內反射顯微鏡的測序技術-單分子測序技術的基礎上，總共發現了28萬條序列信息，打開了在單分子且通量高的情況下進行測量序列的大門。然而在通量高情況下檢測的堿基序列如何去解讀，也是科研工作者面臨的科學問題。

2展望

濕地環境中的微生物對維持濕地體系的基本運作以及構造都發揮至關重要的功能。現在針對功能性微生物的調查和分析存在欠缺，在濕地環境中，菌落的功能性是整個濕地系統運行的關鍵，所以研發借助功能基因主導的各種分子技術手段進行探索各種濕地環境中微生物種群的功能特征和差異，辨別和掌握微生物給濕地系統帶來的去污效果，有利于將來對濕地進行開發、利用等方面工作的順利開展。

參考文獻： 

［1］陳宜瑜，呂憲國.濕地功能與濕地科學的研究方向[J].濕地科學，2003，1(1):7-11.

［5］顏慧，蔡祖聰，鐘文輝.磷脂脂肪酸分析方法及其在土壤微生物多樣性研究中的應用[J].土壤學報，2006，43(5):851-859.

［7］鐘文輝，王薇，林先貴，等.核酸分析方法在土壤微生物多樣性研究中的應用[J].土壤學報，2009，46(2):334-143.

［8］高淑靜，吳鳳芝.PCR-DGGE技術在土壤微生物多樣性研究中的應用[J].生物信息學，2008，55(4):174-175.

作者：趙思宇 馬信 陳星宇 王欣鈺 孫長龍 張陽 單位： 沈陽師范大學