毒性化學(xué)品對線蟲感知行為的影響范文

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1材料與方法

1.1實驗用化學(xué)品和儀器耗材野生型線蟲N2和大腸桿菌OP50均由北京生命科學(xué)研究所惠贈。氯化鎘、氟化鈉、二水重鉻酸鈉、氯化錳、敵敵畏、二溴敵草快、五水硫酸銅、硫酸阿托品、苯、氯化鉀、氯化鈉、乳酸、硼酸、乙醇、乙二醇、無水-2-丙醇、甘油、甲醇、三氯乙酸、次氯酸鈉、檸檬酸等試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。主要儀器:電子天平、漩渦震蕩儀、離心機(jī)、搖床、超凈工作臺、20℃恒溫培養(yǎng)箱、15℃恒溫培養(yǎng)箱和體視顯微鏡(MoticSMZ-140series)。

1.2線蟲的培養(yǎng)和試劑的配制常規(guī)方法培養(yǎng)線蟲，將線蟲同步化到L4期備用。趨避和趨向?qū)嶒炗门囵B(yǎng)基(2.5g蛋白胨、17g瓊脂加超純水至1L，高壓滅菌)、疊氮化鈉(1mol/L)、五水硫酸銅(100mmol/L)、丁二酮(1%體積分?jǐn)?shù))、K-medium溶液(51mmol/L氯化鈉，32mmol/L氯化鉀)、線蟲染毒液(以K-medium溶液為溶劑，2.15倍比稀釋至所需濃度)。

1.3線蟲的染毒劑量用K-medium溶液洗下L4期的線蟲至50ml的離心管中，沉淀后立即用20ml的K-medium溶液洗3次。體視顯微鏡下調(diào)配線蟲的只數(shù)，使線蟲的密度在每20μl50只左右。向24孔板中加入等量的化學(xué)品和線蟲液，6h后觀察線蟲死亡情況，以線蟲無非正常死亡的最高濃度為趨避和趨向?qū)嶒灥淖罡邉┝繚舛龋⒁来伟?.15倍比稀釋，每化學(xué)品4個濃度梯度(表1)。

1.4趨避實驗參考Li等］及Stephen等的實驗方法，具體步驟如下:將9cm的含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿等分為4個區(qū)域;在十字區(qū)域的一對側(cè)培養(yǎng)基上各涂布25μl的100mmol/L的五水硫酸銅溶液，靜置1～2h，等五水硫酸銅溶液滲入到培養(yǎng)基，在另一對側(cè)各滴加50只左右L4期的染毒線蟲(K-medium溶液處理過的線蟲作為陰性對照)。實驗6h后，分別計數(shù)兩對側(cè)培養(yǎng)基上的線蟲數(shù)(壓在十字線上的不計數(shù))，分析線蟲是否進(jìn)入含有Cu2+的區(qū)域;實驗組和對照組各4個平行樣，計算趨避指數(shù)=含Cu2+培養(yǎng)基上線蟲數(shù)目/培養(yǎng)基上線蟲總數(shù)。

1.5趨向?qū)嶒瀰⒖糒i等、Bargmann等、Bargmann和HorvitzHR［8］的實驗方法，具體步驟如下:在含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中標(biāo)記距離培養(yǎng)皿圓心均為2cm的兩點;在其中一個標(biāo)記點上加1μl1%丁二酮(體積分?jǐn)?shù))和1μl1mol/L疊氮化鈉，另一標(biāo)記點加1μl1mol/L疊氮化鈉，在距離上述兩點3cm處滴加100只左右L4期的染毒線蟲(K-medium溶液處理過的線蟲作為陰性對照);靜置6h后，計數(shù)距離兩標(biāo)記點

1.5cm范圍內(nèi)的線蟲數(shù)和線蟲總數(shù);實驗組和對照組各4個平行樣，計算趨向指數(shù)=(丁二酮側(cè)線蟲數(shù)－疊氮化鈉側(cè)線蟲數(shù))/培養(yǎng)基上線蟲總數(shù)。

1.6實驗數(shù)據(jù)處理組內(nèi)兩兩比較:以不同濃度化學(xué)品的銅離子側(cè)線蟲平均數(shù)(趨避實驗)/丁二酮側(cè)－疊氮化鈉側(cè)線蟲平均數(shù)、線蟲總數(shù)平均數(shù)、對照組銅離子側(cè)線蟲平均數(shù)/丁二酮側(cè)－疊氮化鈉側(cè)線蟲平均數(shù)和對照組線蟲總數(shù)平均數(shù)，構(gòu)建四格表資料，應(yīng)用SPSS軟件中的卡方檢驗(Crosstabs)做統(tǒng)計分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。組間比較:以銅離子側(cè)線蟲平均數(shù)/丁二酮側(cè)－疊氮化鈉側(cè)線蟲平均數(shù)、線蟲總數(shù)平均數(shù)，應(yīng)用SPSS軟件對化學(xué)品的5個濃度(包含對照組)做R乘C列的卡方檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果與分析

2.1趨避實驗結(jié)果與對照組比較，若任一劑量的雙側(cè)P值＜0.05，即判斷該化學(xué)品為趨避實驗陽性。趨避實驗為陽性的化學(xué)品共7個:二水重鉻酸鈉、氟化鈉、乙二醇、二溴敵草快、次氯酸鈉、乳酸和苯(表2)。

2.1.1化學(xué)品的趨避指數(shù)與GHS分級:隨著GHS級別的升高，不同毒性等級趨避實驗的陽性率有降低的趨勢(表3)。

2.1.2趨避實驗陽性劑量與GHS分級:隨著GHS級別的升高，不同毒性等級出現(xiàn)趨避實驗陽性的最高劑量值有增大的趨勢(表3)。

2.1.3趨避實驗最高劑量與24hLC50值:出現(xiàn)趨避實驗陽性的7個化學(xué)品中，GHSIII到V級，其24hLC50值約為本趨避實驗最高劑量的2～7倍;GHSVI級，其24hLC50值約為本趨避實驗最高劑量的10～12倍(表4)。

2.2趨向?qū)嶒灲Y(jié)果與對照組相比較，若任一劑量的雙側(cè)P值＜0.05，即判斷該化學(xué)品為趨向?qū)嶒炾栃浴Ｚ呄驅(qū)嶒灋殛栃缘幕瘜W(xué)品共15個:二水重鉻酸鈉、氟化鈉、三氯乙酸、甲醇、乙二醇、硫酸阿托品、甘油、次氯酸鈉、乳酸、檸檬酸、氯化錳、氯化鈉、氯化鎘、硼酸、苯(表2)。

2.2.1化學(xué)品的趨向指數(shù)與GHS分級:隨著GHS級別的升高，不同毒性等級趨向?qū)嶒炾栃月视猩叩内厔?表3)。

2.2.2趨向?qū)嶒炾栃詣┝颗cGHS分級:隨著GHS級別的升高，不同毒性等級出現(xiàn)趨向?qū)嶒炾栃缘淖罡邉┝恐涤性龃蟮内厔?表3)。

2.2.3趨向?qū)嶒炞罡邉┝颗c24hLC50值:出現(xiàn)趨向?qū)嶒炾栃缘?5個化學(xué)品中，GHSⅢ到Ⅵ級，多數(shù)化學(xué)品的線蟲24hLC50值約為本趨向?qū)嶒炞罡邉┝康?～12倍(表5)。

3討論

作為具有諸多優(yōu)勢的體內(nèi)模式生物，線蟲在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛，如應(yīng)用線蟲研究重金屬［9］及農(nóng)藥的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)及其機(jī)理。在化學(xué)品的毒性篩檢方面，線蟲的應(yīng)用也有了一定的研究成果［1，3-4］，另外，王曉祎等利用線蟲對農(nóng)藥廢水開展了相關(guān)分離組分的毒性評價研究，顯示了線蟲在化學(xué)品毒性評價中的重要作用。線蟲的趨避實驗及趨向?qū)嶒炇茄芯烤€蟲感知行為的經(jīng)典方法。2000年，Stephen等［6］通過線蟲對Cu2+的趨避作用，探討了突變體以及動力蛋白重鏈的缺失對線蟲趨避行為的影響。Saeki等［12］通過趨向性實驗，將線蟲暴露于高劑量重金屬離子，證明了重金屬離子對線蟲的感知行為有破壞作用。在本實驗室前期對21種化學(xué)品進(jìn)行了急性毒性研究的基礎(chǔ)上，本研究采用GHS不同毒性等級的21個化學(xué)品的不同濃度對線蟲進(jìn)行6h亞急性染毒，通過趨避實驗和趨向?qū)嶒灒^察化學(xué)品對線蟲感知行為的影響，初步探討趨避指數(shù)與趨向指數(shù)這2個非致死性亞急性指標(biāo)與化學(xué)品毒性分級的聯(lián)系，以及該兩項指標(biāo)與線蟲急性毒性指標(biāo)(24hLC50)的內(nèi)在聯(lián)系及劑量關(guān)系，并據(jù)此推薦適于今后線蟲亞急性毒性研究的初始檢測指標(biāo)及可供參考的劑量范圍。由于GHS6個毒性等級中的Ⅰ和Ⅱ級的化學(xué)品屬于特殊管制類化學(xué)品，本研究只選取了Ⅲ到Ⅵ毒性等級的化學(xué)品。

3.1化學(xué)品的線蟲趨避指數(shù)與其GHS分級、24hLC50有一定關(guān)聯(lián)趨避實驗結(jié)果顯示:與對照組相比，21個化學(xué)品中有7個出現(xiàn)趨避實驗陽性;隨著GHS分級升高(化學(xué)品毒性降低)，趨避實驗的陽性率有降低的趨勢，趨避實驗陽性的最高劑量值有隨GHS級別升高而升高的趨勢;GHSⅢ到Ⅴ級，線蟲24hLC50值約為本趨避實驗最高劑量的2～7倍，GHSⅥ級，24hLC50值約為趨避實驗最高劑量的10～12倍。未染毒的對照組線蟲對五水硫酸銅有一定的趨避能力，由于染毒化學(xué)品對線蟲感知行為的影響擾亂了線蟲的趨避能力，使線蟲進(jìn)入了含有銅離子的區(qū)域。本實驗21個化學(xué)品中的7個有趨避能力，可以推斷趨避指數(shù)可以在一定程度上反映化學(xué)品對線蟲的感知行為的毒害作用。GHS毒性等級的分類是根據(jù)大小鼠的毒性實驗得出的，隨著GHS分級的升高，趨避實驗陽性率有下降趨勢，而出現(xiàn)趨避陽性的最高劑量則有升高的趨勢，說明利用線蟲的趨避指數(shù)對化學(xué)品開展感知行為的毒性評價與利用大小鼠開展毒性評價有一定的相關(guān)性。

3.2化學(xué)品的線蟲趨向指數(shù)與其GHS分級、24hLC50有一定關(guān)聯(lián)趨向?qū)嶒灲Y(jié)果顯示:與對照組相比，21個化學(xué)品中有15個出現(xiàn)趨向?qū)嶒炾栃?隨著GHS分級升高，趨向?qū)嶒灥年栃月视猩叩内厔荩亿呄驅(qū)嶒炾栃缘淖罡邉┝恐狄灿须SGHS級別升高而升高的趨勢;GHSⅢ到Ⅵ級，線蟲24hLC50值約為本趨向?qū)嶒炞罡邉┝康?～12倍。未染毒的對照組線蟲有一定的趨向能力，染毒后的線蟲由于化學(xué)品的不同或濃度的不同會對線蟲的趨向能力產(chǎn)生一定的影響，這種影響可能是增大線蟲的趨向能力，也可能是減弱這種能力。本研究中線蟲趨向陽性的概率較高，說明利用線蟲的趨向指數(shù)評價化學(xué)品對線蟲感知行為的毒性影響有一定的價值。隨著GHS分級的升高，趨向?qū)嶒炾栃月屎统霈F(xiàn)趨向陽性的最高劑量均有升高的趨勢，說明利用線蟲的趨向指數(shù)對化學(xué)品開展感知行為的毒性評價與利用大小鼠開展毒性評價有一定的相關(guān)性。3.3化學(xué)品的線蟲亞急性毒性檢測推薦指標(biāo)及推薦染毒劑量范圍綜上所述，本研究中的趨避指數(shù)和趨向指數(shù)與化學(xué)品毒性大小相關(guān)聯(lián)，可以將這2個指數(shù)作為研究化學(xué)品的線蟲亞急性毒性初始檢測的推薦指標(biāo)。線蟲6h染毒的趨避實驗的推薦染毒劑量:GHSⅢ到Ⅴ級，最高劑量為線蟲24hLC50值的1/7～1/2，GHSⅥ級，最高劑量為線蟲24hLC50值的1/12～1/10;線蟲6h染毒的趨向?qū)嶒灥耐扑]染毒劑量:GHSⅢ到Ⅵ級，最高劑量為線蟲24hLC50值的1/12～1/2。基于本實驗結(jié)果，推薦今后線蟲的亞急性毒性實驗的最高染毒劑量為其24hLC50的1/12～1/2。

4結(jié)論

21個化學(xué)品中，二水重鉻酸鈉、氟化鈉、乙二醇、硫酸阿托品、次氯酸鈉、乳酸和苯7個化學(xué)品同時出現(xiàn)趨避和趨向?qū)嶒炾栃裕疫@7個化學(xué)品分布在GHSⅢ到Ⅵ級的4個毒性等級中，可以進(jìn)一步說明線蟲的趨避指數(shù)和趨向指數(shù)與化學(xué)品毒性大小有一定的關(guān)聯(lián)性，可以將這2個指標(biāo)作為研究化學(xué)品的線蟲亞急性毒性檢測的初始檢測指標(biāo)。但是，每一毒性等級并不是所有化學(xué)品均對上述兩項指標(biāo)敏感，說明在化學(xué)品亞急性染毒條件下，趨避指數(shù)和趨向指數(shù)作為線蟲的亞急性毒性評價指標(biāo)有一定的局限性，故推薦其用于評價那些對線蟲感知行為有影響的化學(xué)品的亞急性非致死性毒性效應(yīng)。同時，本研究的染毒劑量范圍和評價模式為今后化學(xué)品的線蟲亞急性毒性其他指標(biāo)的評價研究提供了實驗研究基礎(chǔ)，具有一定的參考價值。

作者：曾迎新孔慶征李煜敬海明馬玲寧鈞宇譚壯生高珊李國君單位：首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院北京市疾病預(yù)防控制中心/北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室