分子生物技術(shù)在中藥鑒定中應(yīng)用范文

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【摘要】分子生物技術(shù)與植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)研究的結(jié)合，使中藥品種研究進(jìn)入了一個(gè)新的高度。中藥材（不含礦物藥）所依賴的生物資源的多樣性是基于其基因的多態(tài)性結(jié)果，而基因多態(tài)性可在分子水平上檢測，它是比在形態(tài)、組織、化學(xué)水平上的檢測更能代表其變異類型的遺傳標(biāo)記。

【關(guān)鍵詞】分子生物技術(shù)；基因技術(shù)；中藥鑒定

近年來分子生物技術(shù)與植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)研究的結(jié)合，使中藥品種研究進(jìn)入了一個(gè)新的高度。中藥材（不含礦物藥）所依賴的生物資源的多樣性是基于其基因的多態(tài)性結(jié)果，而基因多態(tài)性可在分子水平上檢測，它是比在形態(tài)、組織、化學(xué)水平上的檢測更能代表其變異類型的遺傳標(biāo)記。目前，用于中藥鑒別的分子生物學(xué)方法主要有：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA、DNA直接測序法、限制性片斷長度多態(tài)性分析技術(shù)、多聚酶鏈反應(yīng)測序技術(shù)、生物芯片技術(shù)、DNA指紋技術(shù)等。

1基因技術(shù)

1.1DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)［1］

這是一種根據(jù)不同生物個(gè)體遺傳物質(zhì)DNA的差異來鑒別生物物種的方法。生物的外觀性狀、細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、蛋白質(zhì)等不僅受遺傳因素的影響，還與生物的生長環(huán)境、發(fā)育階段、生理狀態(tài)有關(guān)。而DNA作為遺傳信息的直接載體，不受上述因素的影響，因此DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別藥材的方法具有高度的準(zhǔn)確性與可靠性。（1）限制性片段多態(tài)性（RFLP）是依據(jù)不同植物個(gè)體來源的DNA所形成的不同的譜帶模型與低拷貝的DNA探針雜交得到DNA的限制性片段多態(tài)性，它代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段在長度上的差異。（2）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）原理是根據(jù)DNA聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR），采用人工合成的隨機(jī)引物，以植物組織分離的基因組DNA為模板，進(jìn)行多態(tài)性DN段的隨機(jī)合成反應(yīng)，從而根據(jù)DN段，將植物不同基因組予以區(qū)別。（3）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）是RFLP和RAPD兩種技術(shù)相結(jié)合的一種分子標(biāo)記技術(shù)，既有RFLP的專一性、可靠性，又有RAPD技術(shù)的隨機(jī)性、方便性。如：用AFLP技術(shù)構(gòu)建人參和西洋參的指紋圖譜，具有豐富的多態(tài)性，對鑒別真假人參、人參品種提供了非常有效的工具。用AFLP技術(shù)對石斛屬植物進(jìn)行了鑒定，具有快捷、準(zhǔn)確、可信度高的特點(diǎn)。（4）DNA測序法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為測序引物，提高了DNA序列分析的效率。直接對某基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，找出其種屬特異性來鑒別中藥其中常用的基因片段包括線粒體細(xì)胞色素和rRNA基因等。如龜甲的鑒定［2］。

1.2mRNA差異顯示技術(shù)

該法旨在找出不同組織或細(xì)胞在基因表達(dá)上的差異，是通過將RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，然后PCR擴(kuò)增，最后分離不同分子大小的DNA，挑選出有差異表達(dá)的基因進(jìn)行序列分析，這樣既可以制備探針用于穩(wěn)定靈敏的檢測實(shí)驗(yàn)，亦可制備其蛋白產(chǎn)物及其抗體進(jìn)行免疫檢測［3］。借助該技術(shù)可以將種植與野生的植物藥、道地藥材與普通藥材之間的差異鑒別出來。

2DNA序列標(biāo)記技術(shù)

基于PCR的DNA直接測序技術(shù)是以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為測序引物，極大地提高了DNA序列分析的效率。目前用于DNA測序的基因，主要有植物類葉綠體基因組的rbcL，matKy與核基因組的rRNA，ITS等，動(dòng)物類線粒體基因組的cytb［13］。利用特異性引物對當(dāng)歸、大黃種子中rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，并將其堿基序列測定，結(jié)果顯示當(dāng)歸、大黃種子rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的堿基序列具有明顯的差異和可對比性，不同植物中藥材種子rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)堿基序列可作為從分子水平進(jìn)行鑒定的標(biāo)記。如測定分析了8種24個(gè)麻黃樣品的ITS序列，8個(gè)種被分成3個(gè)群體，分類結(jié)果與地理關(guān)系相一致，顯示出了地理差異性，同時(shí)依此結(jié)果設(shè)計(jì)了一套引物用于不同產(chǎn)地麻黃的鑒別［3］。但常規(guī)PCR所需的引物對必須是在已知靶DNA序列的前提下才能設(shè)計(jì)、合成，這大大限制了未知序列的基因組DNA擴(kuò)增的應(yīng)用范圍。

3生物芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是指采用原位合成或顯微打印手段，將數(shù)以萬計(jì)的DNA探針固定于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記樣本雜交，通過檢測雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對生物樣品的快速、并行、高效檢測或醫(yī)學(xué)檢測。基因芯片鑒別中藥材這一技術(shù)的前提是獲取不同的中藥樣本的特異性基因序列，即基因分型。研究者找出某種中藥品種的特定基因或DNA序列后，將這些特定序列作為探針固定于玻片上制成基因芯。當(dāng)一個(gè)來自植物或動(dòng)物的中藥樣本中含有與之互補(bǔ)的特定基因片段時(shí)，基因芯片可將其測試出來，由單片芯片就可用于多種中藥樣品鑒別［4］。生物芯片在中藥研究中的應(yīng)用，目前還處在摸索階段，其理論與方法還不成熟。隨著生物芯片技術(shù)研發(fā)的進(jìn)行，生物芯片技術(shù)在藥物研究與開發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用也將更廣泛更深入。

總之，利用分子生物技術(shù)鑒別中藥的方法與傳統(tǒng)的中藥鑒別方法相比具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好、真實(shí)、穩(wěn)定、可靠的優(yōu)點(diǎn)。分子生物技術(shù)在中藥鑒定實(shí)踐中的不斷應(yīng)用和日臻完善，利用現(xiàn)代化分析技術(shù)鑒別中藥的真?zhèn)?，?chuàng)建更為先進(jìn)的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，發(fā)展現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制技術(shù)，已經(jīng)成為保證中藥安全、有效、可控，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵。新晨：

【參考文獻(xiàn)】

［1］方和桂.基因技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用［J］.中草藥，2006，37（2）：315.

［2］StudyonPCRidentificationoftheChinesecrudedrOviductusRanae［J］.ApplEnvironmBiol，2000，6（2）：166167.

［3］ShiMM.Enablinglargescalepharmacogeneticsstudiesbyhighthroughputmutationdetectionandgenotypingtechnologies［J］.ChinchemLett，2001，47（2）：164.

［4］CaiZH，LiP，DongTTX，etal.Moleculardiversityof5rRNAspacerdomaininFritillariaspeciesrevealedbyPCRanalysis［J］.PlantaMed，1999，65（4）：360